移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成
Summary
胞胚や原腸胚の段階で移植の対象となるキメラゼブラフィッシュの胚を生成するためのステップバイステップのガイド。
Abstract
複雑な発達過程を把握するために使用される最も強力なツールの一つは、キメラ胚の解析です。キメラは、複数の動物からの細胞を含む生物として定義され、モザイクには、複数の遺伝子型の細胞は通常、野生型と変異体、混合されているキメラの一種です。ゼブラフィッシュでは、キメラが容易に適切な初期段階での宿主胚にドナー胚からの細胞の移植によって作製することができる。標識されたドナーの細胞は、1細胞期胚に蛍光色素などの系列のマーカー、、の注入によって生成されます。標識されたドナー細胞は、ドナー胚から取り出され、化合物または解剖顕微鏡のどちらかに取り付けられたオイル制御のガラスピペットを使用して、ラベルなしホスト胚に導入されています。ドナー細胞は、いくつかのケースでは定評のある運命のマップに基づいて、ホスト胚の移植部位を選択することで、開発胞胚や原腸胚段階のホスト胚の特定の地域や組織をターゲットとすることができます。
Protocol
Discussion
移植を対象とキメラを生成するために使用することができる容易さは、脊椎動物のモデルとしてゼブラフィッシュの列強の一つです。上記以外のこのプロトコルの変更は、接合体の開発において重要な役割を持つ遺伝子の母性遺伝子機能の解析が可能になります。これらの変異体の魚が大人になるまで生き残ることができないので、それは変異細胞の"生殖クローン"を作成し、そうで?…
Acknowledgements
この記事の執筆中に役立つ、入力用Moensラボのメンバーに感謝します。 HKは、NIH / NICHD助成金＃5R01HD037909 – 08でサポートされているポスドク研究員です。 CBMは、ハワードヒューズ医学研究所との研究者でもある。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
| Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
| Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
| Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
| micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
| Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
| Depression slides | Fisher | 12560A | ||
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
Riferimenti
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