공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작
Summary
성인 심장 myocytes 동물 마음으로부터 격리하고 며칠 동안 교양 수있는 기본 세포입니다. 이 문화가 기간 내에 adenoviral 유전자 전송은 유전자 인코딩 biosensors (GEBs) 또는 형광 융합 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. 두 접근 방법 공촛점 현미경에 의해 세포 조사를 허용합니다.
Abstract
어른 마음으로부터 격리 심장 myocytes 널리 어딘가 모델 한쪽에 배아 및 신생아 근육 세포, 다른 작업을 마음 사이의 중간 계산으로만 쓰여집니다. 따라서, cardiomyocytes 심장 세포 생리학과 pathophysiology 좋은 모델 역할, 제약 수사뿐만 아니라 유전자 변형 동물 모델의 탐험하십시오. 여기서 우리는 마음에서 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 또한 우리는 심장 myocytes에 대한 유전자 조작은 유전자 변형 동물을 사육하지 않고 수행할 수있는 방법을 보여주 : 이것은 장기적인 문화의 결합 (1 주) 및 adenoviral 유전자 전달됩니다. 후자의 하나는 바이러스의 건설에서 세포의 형질 도입에 설명되어 있습니다. 그것은 유전자 인코딩 biosensors (GEBs), 형광 융합 단백질의 표현을 위해 사용뿐만 아니라 표현 이상의 단백질과 규정, 예를 들어 RNAi를 사용하여 아래하실 수 있습니다. 여기 subcellular 구조 (잠돌군 Zz)를 얼룩 융합 단백질의 표현에 대한 예제를 제공합니다. 이러한 단백질 표현 subcellular 구조의 3 차원 재건에 대한 Z – 스택의 공촛점 이미징에 의해 시각하실 수 있습니다. 프로토콜은 세포 배양, 분자 생물학 및 생물 물리학의 최첨단을 구성하며 따라서 세포 심장에 새로운 지평을 개척을위한 방법을 제공합니다.
Protocol
Discussion
쥐 cardiomyocytes의 격리에 대한 설명하는 절차는 필요한 경우 다른 종, 예를 들어, 마우스 4 적용할 수 있습니다. 적응을 필요로 매개 변수는 소화 효소 혼합 (아래 참조) 또한 소화의 기간입니다. 종 (种) (예 : 마우스)의 세포가 다른 사람 (예 : 쥐)보다 약해있을 것을 알고 있습니다.
collagenase의 선택은 아마도 격리 절차에서 가장 중요한 단계입니다. 그것이 거의없이 배?…
Acknowledgements
이 작품은 독일의 국립 과학 재단 (DFG)와 위험 평가 연방 연구소 (BfR, 독일)에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
| DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
| Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
Riferimenti
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
- Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
- Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. . Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
