Взрослых кардиомиоцитов являются первичные клетки, которые могут быть изолированы от животного сердца и культивировали в течение нескольких дней. В рамках этой культуры периода аденовирусных перенос генов могут быть использованы для выражения генетически закодированы биосенсоров (GEBs) или флуоресцентные белки слияния. Оба подхода позволяют сотовой исследования с помощью конфокальной микроскопии.
Кардиомиоцитов изолированных от взрослых сердца широкое признание в качестве модели где-то на полпути между эмбриональной и неонатальной мышечные клетки с одной стороны и работающем сердце, с другой. Таким образом, кардиомиоцитах служат хорошими моделями для сердечной клеточной физиологии и патофизиологии, для фармацевтических исследований, а также для исследования трансгенных животных моделях. Здесь мы опишем метод выделения клеток из сердца. Кроме того, мы покажем, как генетические манипуляции на кардиомиоциты могут быть выполнены без разведения трансгенных животных: Это сочетание длинных культуры срок (1 неделя) и аденовирусных переноса генов. Последняя описывается от строительства вируса трансдукции клеток. Она может быть использована для выражения генетически закодированы биосенсоров (GEBs), флуоресцентные белки слияния, но и для белка за выражение и вниз регулирования, например, с помощью РНК-интерференции. Здесь мы приведем пример для выражения гибридный белок окрашивания субклеточные структуры (АГ). Такой экспрессии белка могут быть визуализированы с помощью конфокальной визуализации Z-стеки для 3D-реконструкция субклеточных структур. Протокол включает в себя состоянии дел в культуре клеток, молекулярной биологии и биофизики и таким образом обеспечивает подход для изучения новых горизонтов в сотовых кардиологии.
Процедуре, описанной для выделения кардиомиоцитов крысы могут быть адаптированы для других видов, например, мыши 4, если это необходимо. Параметром, который необходимо адаптации фермент смесь для пищеварения (см. ниже), а также продолжительность пищеварения. Имейте в виду, что кле?…
Работа выполнена при поддержке Немецкого Национального научного фонда (DFG) и Федерального института оценки рисков (BfR, Германия).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |