共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作

Summary

成人心筋細胞は動物の心臓から分離し、数日間培養することができる主要な細胞である。この培養期間内にアデノウイルス遺伝子導入は、遺伝的に符号化されたバイオセンサー（GEBs）または蛍光融合タンパク質を発現させることができる。両方のアプローチは、共焦点顕微鏡による細胞の調査を許可する。

Abstract

成人の心臓から単離された心筋細胞は広くどこかにモデル片側の胚および新生児の筋細胞と他の上で働く心臓の間に半分の方法として受け入れられています。従って、心筋細胞は心臓細胞生理および病態生理のため、医薬品の調査のためだけでなく、トランスジェニック動物モデルを検証するための良いモデルとなる。ここでは、心臓から細胞を単離する方法を説明します。さらに我々は心筋細胞で遺伝子操作がトランスジェニック動物を飼育することなく実行できる方法を示します：これは長期の培養（1週間）とアデノウイルス遺伝子導入を組み合わせたものです。後者は、ウイルスの構造から細胞の形質導入に記述されています。それは、RNAiを用いて、例えば、発現とダウンレギュレーションを介して遺伝的に符号化されたバイオセンサー（GEBs）、蛍光融合タンパク質を発現させるためだけでなく、蛋白質に使用することができます。ここでは、細胞内構造（ゴルジ体）を染色する融合タンパク質を発現させるための例を提供しています。このようなタンパク質の発現は、細胞内構造の3次元再構築のためのz -スタックの共焦点イメージングで可視化することができる。プロトコルは、細胞培養、分子生物学と生物物理学の最先端を構成し、従って細胞の心臓病の新たな地平を探索するためのアプローチを提供します。

Protocol

4つの主要な段階を含むプロトコルのすべての設計上の図1に示します。すべてのステップは、完全な詳細に説明されています。 24時間後に約共焦点イメージングに続いて細胞の分離、伝達と文化は、連続すると強制的なタイムスケールです。ウイルスの構造は、先に細胞の分離の行われる必要がありますし、遺伝的形質導入のために使用されます。 1。ラットの心臓から?…

Discussion

ラット心筋細胞の単離のために説明する手順は、必要に応じて他の種、例えばマウス⁴に適合させることができます。適応を必要とするパラメータは、消化のための酵素ミックス（下記参照）、また、消化の期間です。一部の種（例えばマウス）の細胞が他の人（例えばラット）よりも壊れやすいかもしれないことに注意してください。

コラゲナーゼの選択は、?…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Anesthesia solution		Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)		Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid)
Citrate solution				117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution
Solution A				134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered
Solution A+				Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered
Liberase solution		F. Hoffmann‐ La Roche Ltd.	11988476 001	500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.)
Solution B				Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution
Solution B1/2				1:1 mixture of solution A and solution B
DNase solution		Sigma‐ Aldrich Co.	D4527	Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol
Extracellular matrix protein (ECM) solution		Extracellular matrix protein (ECM) solution	E1270	1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199
Culture medium M199		PAA	E15‐834	Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml)
ITS solution				25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen.
Tyrode				135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered
Master mix				5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample
LB‐Medium				10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0
Pac I		New England Biolabs	R0547L	preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl