Yüksek kalitede izolasyonu, RNA bozulmamış birçok laboratuar protokolleri önemli bir adımdır. Burada, bütün zebrafish embriyolar ve gen ekspresyon mikrodizi analizi de dahil olmak üzere çeşitli deneysel prosedürleri müteakip uygulama için cDNA sentezi RNA ekstraksiyon göstermektedir.
Abstract
Birçok önemli ve karmaşık laboratuvar işlemleri, yüksek kaliteli, sağlam RNA bir giriş gerektirir. Bozulmuş bir örnek veya yabancı maddelerin varlığı downstream deneysel uygulamalar felaket sonuçlarına yol açabilir. , Bu nedenle üstün bir örnek sağlamak için çok sayıda güvence ve kalite kontrol katı tekniklerini kullanmak için büyük önem taşımaktadır. Burada, biz detay izleri ticari bir RNA izolasyon kiti kullanılarak DNA ve kirleri çıkarmak için, piyasada yaygın olarak bulunan kimyasal denaturant ve daha sonraki temizleme kullanarak tüm zebrafish embriyolar toplam RNA izole etmek için bir protokol. RNA nispeten istikrarsız ve RNAses tarafından bölünme kolayca eğilimli olduğu gibi, çoğu protokolleri tahlil gen ekspresyon doğrudan bir RNA sentezlenir bir cDNA ürün. Biz, ayrıntılı bir prosedür RNA ticari kiti kullanılarak, daha istikrarlı bir cDNA ürün haline dönüştürmek için. Bu işlemler boyunca örnek bozulmuş veya kontamine olmadığından emin olmak için birçok kalite kontrol vardır. Mikroarray analizi, RT-PCR veya uzun süreli depolama için uygun olup olmadığını bu protokollerin son ürün cDNA.
Protocol
Bölüm 1: TRIzol Reaktif kullanarak Total RNA ekstraksiyonu RNA ile çalışırken RNAses serbest olduğu bir ortamda çalışmak çok önemlidir. Sadece RNA prosedürleri ile kullanım için ayrılmış pipetler ve prosedürü başlamadan önce bir dekontaminant reaktif (örneğin, RNAse Uzakta) ile çalışma alanı püskürtme gibi basit önlemler çok yararlı. 1,5 ml mikrofuge'de tüpünde RNA havuzu 50 zebrafish embriyoların yeterli miktarda elde etmek ve bir pipet ile…
Discussion
RNA molekülü kırılganlık bu protokolü boyunca hatırlanması gereken gereken en önemli husustur. RNAse-ücretsiz steril laboratuvar RNAse serbest bölge her zaman kullanılmalıdır. Sadece RNA işlemleri için kullanılacak laboratuvar bir bölümünü ayırmak için yararlı olur. Bu alan, sık sık Away gibi RNAse RNAse kaldırarak ürün, püskürtülmüş olmalıdır. RNA örnekleri her zaman eldiven ile ele almış ve bozulmasını önlemek için buz üzerinde tutulmalıdır olmalıdır.
<p class="jove_…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Glycogen (5 mg/ml)
Ambion
9510
NanoDrop ND-100
Thermo Scientific
ND-1000
Pellet Pestles with Microfuge Tube
VWR
KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml
Eppendorf
2302800
Phenol, Tris-saturated
Roche Diagnostics
3117944001
RNAse Away
VWR
17810-491
RNAse-Free DNase Set
Qiagen
79254
RNEasy Mini Kit
Qiagen
74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR
Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470, doi:10.3791/1470 (2009).