RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Summary

Die Isolierung von hoher Qualität, ist intakte RNA ein wesentlicher Schritt in vielen Labor-Protokolle. Hier zeigen wir, die RNA-Extraktion aus ganzen Zebrafisch-Embryos und cDNA-Synthese für die spätere Anwendung in verschiedenen experimentellen Verfahren, einschließlich Genexpression Microarray-Analyse.

Abstract

Viele wichtige und komplexe Labor-Verfahren erfordern eine Eingabe von hoher Qualität, intakte RNA. A abgebaut Probe oder das Vorhandensein von Verunreinigungen können zu katastrophalen Ergebnissen in nachgelagerten experimentelle Anwendungen führen. Es ist daher von größter Bedeutung, solide Technik mit zahlreichen Sicherheitsvorkehrungen und Qualitätskontrollen zu verwenden, um ein überlegenes Probe zu gewährleisten. Hier berichten wir ausführlich ein Protokoll zur Gesamt-RNA aus ganzen Zebrafisch-Embryos mit einem handelsüblichen chemischen Denaturierungsmittel und anschließender Bereinigung um Spuren von DNA und Verunreinigungen unter Verwendung eines handelsüblichen RNA Isolation Kit entfernen zu isolieren. Als RNA ist relativ instabil und leicht anfällig für Spaltung durch RNAsen, mit den meisten Protokollen Assay Genexpression einer cDNA-Produkt, das direkt von einer RNA-Matrize synthetisiert wird. Wir Detail ein Verfahren zur RNA in die stabilere cDNA-Produkt mit einem kommerziell erhältlichen Kit zu konvertieren. Während diese Verfahren gibt es zahlreiche Qualitätskontrollen, um sicherzustellen, dass die Probe nicht abgebaut wird oder verschmutzt. Das Endprodukt dieser Protokolle cDNA, die für Microarray-Analyse, RT-PCR oder langfristige Lagerung ist.

Protocol

Teil 1: Extraktion von Gesamt-RNA mit Trizolreagenz Beim Arbeiten mit RNA ist es sehr wichtig, um in einem Umfeld, das frei von RNasen ist die Arbeit. Einfache Vorsichtsmaßnahmen wie mit reservierten Pipetten für die Verwendung nur mit RNA Verfahren und Besprühen der Arbeitsbereich mit einem Dekontaminationsmittel Reagenz (zB RNAse Away) vor Beginn des Verfahrens sind sehr hilfreich. Um eine ausreichende Menge an RNA Becken 50 Zebrafischembryonen in einem 1,5 ml Mikrozentrifuge…

Discussion

Die Fragilität des RNA-Moleküls ist die kritische Betrachtung, die in diesem Protokoll darf nicht vergessen werden. Sterile Geräte, RNAse-frei ist, sollte immer in einem RNAse-freien Zone des Labors eingesetzt werden. Es ist hilfreich, ein Teil des Labors für RNA Verfahren nur verwendet werden, behalten. Dieser Bereich sollte häufig mit einer RNAse Entfernen Produkt, wie RNase AWAY gesprüht werden. Die RNA-Proben sollten immer mit Handschuhen angefasst werden und auf Eis gehalten, um den Abbau zu verhindern.

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Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Glycogen (5 mg/ml)		Ambion	9510
NanoDrop ND-100		Thermo Scientific	ND-1000
Pellet Pestles with Microfuge Tube		VWR	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml		Eppendorf	2302800
Phenol, Tris-saturated		Roche Diagnostics	3117944001
RNAse Away		VWR	17810-491
RNAse-Free DNase Set		Qiagen	79254
RNEasy Mini Kit		Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR		Invitrogen	11904-018
TRIzol		Invitrogen	15596-026