Summary
Protocol
共有骨髓的准备
- 四B6小鼠牺牲和胫骨,股骨,髋部和脊柱解剖获得。
- 在解剖,四肢和骨骼都保存在PBS 2%FCS的热灭活(可选2MM的EDA - 夹层介质)。
- 干净的骨头被压碎用迫击炮和杵在夹层介质。做一个有效的方法是粉碎一次每只小鼠的胫骨,股骨和髋部,然后2刺。
- 从每个鼠标中获得细胞的混合物被单独存放,并通过50毫升猎鹰管成40微米过滤器过滤。在这种方式中,每管含有细胞的混合物,获得了所有的鼠标,从2棘获得的混合物的一半腿骨。在这个阶段,过滤器是用于单独的骨骼碎片。
- 它通常是最好粉碎腿骨两次获得白(无骨髓)碎骨,脊柱片段2或3倍。
- 填充管他们平衡,旋转5分钟1200RPM。
- 吸上清,松开拖管的管架(每个离心后,以尽量减少聚集形成和细胞的损失,这一步很重要)沉淀。重悬在每管1毫升PBS 2%FCS(没有EDTA从现在开始,)如果你正在做血统的枯竭,或在任何音量,否则您方便。
天堂枯竭
- 此过程可以消除高度分化的细胞,并获得一个非常庞杂的人口细胞,干细胞和祖细胞丰富。如果你是排序的HSC,这一步大幅降低的细胞通过细胞分选去的数量,从而减少排序的时间,并允许排序的HSC较高的小鼠,让你可以得到一个较高的数字的HSC在一个单一的排序。
- 如果你要排序后,取出的细胞混合排序控件(未染色和SCA1,CD48,c - Kit的Flk2单一的颜色控制)(我通常采取从每个管位)50μL。
- 新增林鸡尾酒30ml/tube。天堂鸡尾酒含有多种抗体,不幸变化不大,从实验室到实验室。在Scadden实验室,我们使用biotinilated抗体对GR1,Ter119,CD4 +,CD8 +,CD3 +,B220。他们在染色的最终稀释度为1:700。
- 涡迅速混合,孵育15分钟,在4 ° C。
- 在孵化期间,准备上的磁铁和下15毫升洗脱列管的列。德加一些PBS使用steriflip过滤器(你应该看到迈向由于负压吸引的PBS表面的小气泡),和平衡3毫升脱气PBS每一列列。
- 柱流量约1ml/5min,所以准备使用的列,它大约需要15分钟。
- 在孵化结束,加PBS洗涤2%FCS的填补管和旋转5分钟,在1200RPM。
- 吸出上清液,松开颗粒和悬浮在1毫升/脱气PBS管。
- 如果你是排序后,取出天堂单一颜色的染色CTRL总骨髓(15毫升,每管位)。
- 添加30ml/tube链亲和素珠,涡迅速混合,孵育15分钟,在4 ° C。
- 在孵化结束,加2毫升/管脱气PBS。把下列新的收集管,并适用于每一个暂停一列,通过40微米的过滤器进行过滤。
- 每管加入另3毫升脱气PBS洗。一旦列是空的,再次申请使用相同的40微米过滤器。
- 洗脱液包含枯竭的谱系细胞的混合物,异构的人口为干细胞和祖细胞丰富。游泳池的内容分为2管,4管。在1500RPM旋转5分钟。
- 吸上清。颗粒应为白色或白色为主。如果你是排序后松开颗粒1毫升总PBS 2%FCS一起重悬,否则悬浮在任何音量方便您。
LKS或的长远的HSC排序
- 取出血统耗尽单一颜色的染色CTRL(15毫升)。这将允许您评估您的血统枯竭的效率。
- 15毫升管染色细胞混合排序。
新增抗体:
SCA PE - Cy5.5 | 1:100 | 10毫升 |
包APC | 1:100 | 10毫升 |
SA的PE - Cy7 | 1:500 | 2毫升 |
要排序长期的HSC,还可以添加:
CD48 FITC | 1:1000 | 1毫升 |
Flk2体育 | 1:200 | 5毫升 |
此外,准备单染色控制使用的总预留保持解剖和骨髓血统染色后的骨髓。这些染色法,流式细胞仪管可以直接到。
确保在黑暗中!
- 涡迅速混合,并在4 ° C时20至30分钟,再搅拌中途孵化。
- 洗去多余的抗体,填补了PBS 2%FCS和自旋为5分钟1500转管。
- 去除上清液,重新悬浮颗粒和移动新流式细胞仪管过滤器盖。它可能需要一段时间来获得的细胞经过这些过滤器,重要的是申请多一些PBS事后冲洗过滤器,最大限度地减少细胞损失。这一步是必要的,以避免堵塞的分拣机,这是最可怕的噩梦的每一个细胞分选仪用户。
- 当交给你的细胞,细胞分选设施,确保还准备与PBS 10%您好FCS的细胞,将收集管。
- 如果你是李嘉诚细胞排序,您将获得一个包含长期和短期的复育HSC和多向祖细胞的异质人口。从4只小鼠的平均产量是30万李嘉诚。
- 如果你也用CD48和Flk2抗体,可以单独每一个长期的HSC,短期HSC和MPP人口。 LT - HSC是最难得的人口。平均产量约5万至6万4小鼠的细胞。
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