In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von<em> Drosophila</em> Peripheren Neuronen mit einem schnellen Magnetic Bead Zellsorting Strategie. RNA aus den isolierten Zellen erhalten kann ohne weiteres für nachgelagerte Anwendungen einschließlich Microarray-Analysen verwendet werden.
Die<em> Drosophila</em> Peripheren Nervensystem (PNS) ist ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der komplexen Prozesse der neuronalen Entwicklung und Dendriten Morphogenese bei der funktionalen und molekularer Ebene. Zur Unterstützung bei diesen Analysen haben wir eine Strategie für die Isolierung von einer Unterklasse von PNS Neuronen so genannten dendritischen Verzweigung (da) Neuronen, die in großem Umfang für das Studium Dendriten Morphogenese verwendet entwickelt<sup> 1,2</sup>. Diese Neuronen sind sehr schwierig, da eine reine Population isoliert, zum Teil aufgrund ihrer extrem geringen Vorkommens und ihrer schwer zu erreichen Lage direkt unterhalb der harten Chitinpanzer Larvencuticula. Unsere neu entwickelte Verfahren überwindet diese Herausforderungen, und ist auf eine schnelle und spezifische Anreicherung von Zellen mit Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen auf. Für unsere Magnetic-Bead-Sortier-Studien haben wir altersmäßig angepassten dritten Larvenstadium eingesetzt Ausdruck einer Maus CD8 getaggt GFP-Fusionsprotein (<em> FH-mCD8-GFP</em>)<sup> 3</sup> Unter der Kontrolle von entweder der Klasse IV dendritische Verzweigung (da) Neuronen-spezifische<em> Taschendieb (PPK)-GAL4</em> Fahrer<sup> 4</sup> Oder die Steuerung der pan-da Neuronen-spezifische GAL4<sup> 21-7</sup> Fahrer<sup> 5</sup>. Obwohl dieses Protokoll für die Isolierung von PNS-Zellen, die an der Innenwand des Larvencuticula befestigt sind, durch die Variation einiger Parameter optimiert wurden, konnte das gleiche Protokoll verwendet, um viele verschiedene Zelltypen an der Nagelhaut an Larven oder Puppen Phasen zu isolieren Entwicklung (z. B. Epithelien, Muskel-, oenocytes etc.) oder andere Zelltypen aus Larvenorgane abhängig von der GAL4-spezifischen Treiber Expressionsmuster. Die RNA durch diese Methode isoliert ist von hoher Qualität und kann ohne weiteres für nachgeschaltete genomische Analysen wie Microarray Gene Expression Profiling Studien verwendet werden. Dieser Ansatz bietet ein leistungsstarkes neues Werkzeug, um Untersuchungen an isolierten durchführen<em> Drosophila</em> Dendritische Verzweigung (da) Neuronen wodurch neue Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Dendriten Morphogenese.
Das Protokoll hier vorgestellten ist für die Isolierung und Aufreinigung von peripheren Neuronen, die eng an die innere Oberfläche der Drosophila dritten Larvenstadium Larvencuticula mit einer Magnetic-Bead-cell sorting Strategie festhalten optimiert. Während wir dieses Protokoll verwendet haben, um gezielt zu isolieren Drosophila da Neuronen, Anwendungen dieses Protokoll, um die Isolation von anderen Zelltypen, die die Kutikula in Larven-oder Puppenstadium Entwicklungsstadien haften (zB Epithelien, Muskeln, andere p…
Wir danken Drs. Yuh-Nung Jan und Wes Grueber für die Bereitstellung von fly Aktien in dieser Studie verwendet. Die Autoren danken Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust für die Unterstützung dieser Forschung (DNC) und der George Mason University Provost Büro (EPRI).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment