Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.
Abstract
Eine Stammzelle ist eine Zelle mit der Fähigkeit, definiert sowohl selbst erneuern und erzeugen mehrere differenzierte Nachkommenschaft. Embryonale Stammzellen (ESC) werden aus der Blastozyste des frühen Embryos abgeleitet und sind in differenzierenden Fähigkeit pluripotent. Ihre große Differenzierungspotential hat sie im Mittelpunkt der Forschung am abzuleiten, wie man sie überreden, um klinisch nützliche Zelltypen erzeugen zentriert. Die erfolgreiche Gewinnung von hämatopoetischen Stammzellen (HSC) aus Maus ESC wurde kürzlich durchgeführt und kann in diesem Video-Protokoll visualisiert werden. HSC, die wohl klinisch genutzt Zellpopulation, werden verwendet, um eine Vielzahl von hämatopoetischen Malignomen und Störungen zu behandeln. Allerdings mangelt es vielen Patienten, die von HSC-Therapie profitieren könnten den Zugang zu geeigneten Spendern. ESC könnte eine alternative Quelle von HSC für diese Patienten. Das folgende Protokoll stellt eine Grundlinie, aus dem ESC-HSC studiert und kann zu informieren Anstrengungen zur HSC aus menschlichem ESC zu isolieren. In diesem Protokoll werden ESC als Embryoidkörpern (EVG) für 6 Tage in kommerziell erhältlichen Serum sorgfältig geprüften optimale hämatopoetische Differenzierung unterschieden. EBs werden dann dissoziiert und infiziert mit retroviralen HOXB4. Mäuse und Co-Kultivierung in Gegenwart von Hämatopoese Zytokine für 10 Tage – Infected EB-abgeleiteten Zellen sind auf OP9 Stroma, eine Knochenmark-Zelllinie, die aus der Schädeldecke des M-CSF-/ abgeleitet überzogen. Während dieser Co-Kultur, die infizierten Zellen stark zu erweitern, was in der Erzeugung einer heterogenen Pool von 100s von Millionen von Zellen. Diese Zellen können dann zu retten und zu rekonstruieren letal bestrahlten Mäusen verwendet werden.
Protocol
Differenzierung von embryonalen Stammzellen Sammle in der Nähe konfluenten Flasche von embryonalen Stammzellen (ESC) über die Behandlung mit ESC Trypsin. Die Zellen in 5 ml Differenzierung Medien und Übertragung auf einen Nicht-Gelatine beschichteten T25. Bei 37 ° C für 45 Minuten. Abrufen Überstand sammeln und Zellen über Zentrifugation. Hinweis: Maus embryonale Fibroblasten (MEFs) aus dem ESC Kulturen legen leicht zu den Nicht-Gelatine beschichteten T25 und damit aus der Kul…
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice
Animal
Taconic Farm
Plate shaker
Tool
VWR
33998-360
Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor
Tool
VWR
15000-174
ePet by BioHit
ES trypsin
Reagent
Invitrogen
15090-046
0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin
Reagent
Invtrogen
25300-062
0.05% Trypsin-EDTA
PBS
Buffer
Invitrogen
20012-027
Enzyme-free dissociation buffer
Buffer
Invitrogen
13151-014
Dissociation enzyme mix
Buffer
Invitrogen
17104-019
500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase
Reagent
Sigma
H2126
freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.