Вывод гемопоэтических стволовых клеток мышей эмбриональных стволовых клеток
Summary
Этот протокол детали вывода трансплантации гемопоэтических стволовых клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и их последующей закачки в смертельно облученных мышей получателя. Короче говоря, ЭСК дифференцируются эмбриоидных органов, которые затем инфицированных ретровирусных HoxB4 и со-культивировали с OP9 стромальные клетки и гемопоэтические цитокины.
Abstract
Стволовых клеток определяется как клетка с возможностью как самостоятельного обновления и создавать несколько дифференцированных потомства. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получают из бластоцист из раннего эмбриона и плюрипотентные в differentiative способности. Их огромный потенциал differentiative сделало их центром внимания для большого исследования сосредоточены на выведении как уговорить их для создания клинически полезным типов клеток. Успешный вывод гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) из мышиных ЭСК было недавно достигнуто, и могут быть визуализированы в этом видео протокол. HSC, пожалуй, наиболее клинически эксплуатируемые популяции клеток, которые используются для лечения множества злокачественных опухолей кроветворной и расстройств. Тем не менее, многие пациенты, которые могли бы извлечь выгоду из HSC терапии не имеют доступа к подходящих доноров. ESC может обеспечить альтернативный источник HSC для этих пациентов. Следующий протокол устанавливает исходных линий, от которых ESC-HSC можно изучать и в усилиях по изоляции HSC из человеческих ЭСК. В этом протоколе, ESC, дифференцируются как эмбриоидных тел (ЭТ) в течение 6 дней в коммерчески доступных сыворотки предварительно отобранных для оптимального гемопоэтических дифференциации. ЭТ затем диссоциирован и инфицированных ретровирусных HoxB4. Зараженные EB-клеток, полученных из высевали на OP9 стромы, стромы костного мозга клеточной линии происходит от черепа М-CSF-/ – мышей, и ко-культивировали в присутствии органов кроветворения содействия цитокинов в течение десяти дней. Во время этого совместного культуры, инфицированных клеток значительно расширить, в результате чего поколения гетерогенных пул 100s из миллионов клеток. Эти клетки затем можно использовать, чтобы спасти и восстановить смертельно облученных мышей.
Protocol
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice | Animal | Taconic Farm | ||
| Plate shaker | Tool | VWR | 33998-360 | Orbital Shaker by Ikaworks |
| Multi-channel pipettor | Tool | VWR | 15000-174 | ePet by BioHit |
| ES trypsin | Reagent | Invitrogen | 15090-046 | 0.25% Trypsin in PBS |
| Standard trypsin | Reagent | Invtrogen | 25300-062 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| PBS | Buffer | Invitrogen | 20012-027 | |
| Enzyme-free dissociation buffer | Buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Dissociation enzyme mix | Buffer | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg Collagenase IV |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H2126 | freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing. |
| DNAse | Reagent | Sigma | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Protamine sulfate | Reagent | Sigma | P3369 | 8 ug/mL |
| EB differentiation media | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM+cytokines | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 20% anti-MEM | Please view recipe on attached Protocol.doc |
