Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.
Abstract
Bir kök hücre kapasitesine sahip bir hücre olarak tanımlanan, hem kendini yenilemek ve birden fazla farklılaşmış döl oluşturmak. Embriyonik kök hücreler (ESC), erken embriyo blastosist türetilmiştir ve pluripotent differentiative yeteneği vardır. Onların engin differentiative potansiyel klinik olarak yararlı bir hücre türleri oluşturmak için onları nasıl ikna edebilmeyi çözmekten merkezli birçok araştırmanın odak yaptı. Fare ESC hematopoietik kök hücrelerin (HSC) başarılı türetme tamamlanmıştır ve bu video protokolde görüntülendi olabilir. HSC, tartışmasız en çok klinik istismar hücre popülasyonu, hematopoetik maligniteler ve bozukluklar sayısız tedavi etmek için kullanılır. Bununla birlikte, birçok hastada HSC tedaviden yarar olabilir uygun donör erişim yoksundur. ESC, bu hastalar için HSC alternatif bir kaynak sağlayabilir. Aşağıdaki protokol ESC-HSC okudu ve insan ESC HSC izole etmek için çabalar bilgilendirmek edilebileceği bir temel kurar. Bu protokol, ESC, piyasada bulunan serum ön elemeden optimal hematopoetik farklılaşma 6 gün embriyoid organları (EBS) olarak ayırt edilirler. EBS sonra ayrışmış ve retroviral HoxB4 ile enfekte. Fare ve ortak kültür varlığı on gün sitokinler teşvik hematopoez – Enfekte EB-elde edilen hücreler, M-CSF / calvaria türetilmiş bir kemik iliği stromal hücre hattı OP9 stroma kaplanmıştır. Bu ko-kültür sırasında, enfekte olan hücreleri nesil 100'ün üzerinde milyonlarca hücreden heterojen bir havuz, büyük ölçüde genişletmek. Bu hücreler daha sonra kurtarma ve sulandırmak ölümcül ışınlanmış fareler için kullanılabilir.
Protocol
Embriyonik Kök Hücre Farklılaşması ESC tripsin ile tedavi ile embriyonik kök hücreler (ESC) yakın bir konfluent balon toplayın. Farklılaşma medya 5 ml hücreleri yeniden süspanse edin ve olmayan bir-jelatin kaplı T25 transfer. 37 ° C'de 45 dakika için. Süpernatant Al ve santrifüj yoluyla hücreleri toplamak. Not: ESC kültürlerden gelen Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) olmayan jelatin kaplı T25 kolayca tutunur ve böylece bu kaplama adımı sırasında kül…
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice
Animal
Taconic Farm
Plate shaker
Tool
VWR
33998-360
Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor
Tool
VWR
15000-174
ePet by BioHit
ES trypsin
Reagent
Invitrogen
15090-046
0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin
Reagent
Invtrogen
25300-062
0.05% Trypsin-EDTA
PBS
Buffer
Invitrogen
20012-027
Enzyme-free dissociation buffer
Buffer
Invitrogen
13151-014
Dissociation enzyme mix
Buffer
Invitrogen
17104-019
500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase
Reagent
Sigma
H2126
freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.