Enregistrement optique de l'activité électrique en Guinée-cochon Réseaux entérique en utilisant la tension colorants sensibles
Summary
Ce protocole illustre comment la tension colorants sensibles pour permettre l'enregistrement optique de l'activité électrique de réseaux de neurones intacts tels que les réseaux de la Guinée-cochon système nerveux entérique, avec une résolution réglable allant de simples cellules à multi-ganglionnaires circuits.
Abstract
Le système nerveux entérique (ENS) est un réseau autonome avec fonctions identifiées, capable de réaliser des comportements complexes dans l'isolement. Ses neurones (10 à 25 um de diamètre) sont disposées en plexus qui se limitent à des plans distincts de la paroi intestinale<sup> 1</sup>, Le plexus myentérique peut être trouvé entre les couches musculaires longitudinales et circulaires, et la sous-muqueuse du plexus entre la couche musculaire circulaire et la muqueuse. Comme les systèmes effecteurs de ces plexus (transportant l'épithélium, les cellules endocrines, les éléments immunitaire, les vaisseaux sanguins et des muscles lisses) sont également contenues dans la paroi intestinale, semi-intactes préparations peuvent être disséqués qui préservent les composants individuels de différentes voies réflexes. Le comportement des systèmes effecteurs est contrôlée par le plexus sous-muqueux et myentériques agissant de concert. Par conséquent, la connaissance détaillée des interactions synaptiques au sein et entre les ganglions, et de la communication entre le plexus, est essentielle pour comprendre la fonction normale gastro-intestinal. L'ENS, comme un système nerveux intact, est un modèle expérimental unique dans lequel on peut corréler les événements moléculaires et cellulaires avec le comportement électrique du réseau neuronal et de ses résultats physiologiques. En raison de l'organisation quasi-bidimensionnelle de son plexus, l'ENS est particulièrement bien adapté pour l'étude des réseaux de neurones à l'aide de multiples techniques de site d'enregistrement optiques qui emploient sensibles au voltage colorants<sup> 2,7,8,9</sup>. Nous allons illustrer ici l'utilisation d'un relativement nouveau naphthylstyryl-pyridinium colorant (di-4-ANEPPDHQ)<sup> 3</sup> Qui offre de multiples avantages par rapport à ses prédécesseurs, y compris la phototoxicité très faible, faible taux d'internalisation et la stabilité chimique remarquable. Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec une caméra qui permet de sous-milliseconde le temps de résolution, ce colorant nous permet de surveiller l'activité électrique de tous les neurones dans le champ de vision avec une résolution maximale spatiale de ~ 2,5 um à un grossissement de 100x. A faible grossissement (10x ou 20x), le sacrifice de simple cellule de résolution est compensée par un gain en perspective, révélant la complexité des circuits inter-ganglionnaires.
Protocol
Discussion
Ce protocole a été écrit avec deux objectifs en tête. Le premier est de convaincre d'autres chercheurs qui, grâce à des nombreux progrès technologiques de la dernière décennie, l'enregistrement optique de l'activité électrique en utilisant la tension colorants sensibles est devenu l'un des plus puissants, des méthodologies fiables et abordables pour étudier les réseaux neuronaux intacts; effet , il pourrait être facilement mis en œuvre, même dans un laboratoire disposant de ressources mo…
Acknowledgements
Nous tenons à remercier DA Coulter (CHOP) pour nous avoir permis d'utiliser ses deux photons microscope pour acquérir les images 2-photons montré au début de la vidéo, et H. Takano pour le partage avec nous son expertise technique.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Medium 199 | Sigma, St. Louis, MO | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate | |
| Sylgard | Dow Corning Corp., Midland, MI | 184 silicone elastomer kit | ||
| Insect pins used for dissection | F.S.T., Foster City, CA | 26001-30 | ||
| Dumont forceps | F.S.T., Foster City, CA | 11203-23 or 11200-33 | ||
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T., Foster City, CA | 15371-92 | ||
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp., Shizuoka, Japan | Seirin Spinex | ||
| Collagenase VII | Sigma, St. Louis, MO | C0773 | ||
| Protease IX | Sigma, St. Louis, MO | P6141 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Carlsbad, CA | 10439-016 | ||
| PenStrep | GIBCO, BRL | 15140 | ||
| L-Glutamine 100X | GIBCO, BRL | 25030 | ||
| Nifedipine | Sigma, St. Louis, MO | |||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Eugene, OR | D36802 | ||
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany | 2000 Series | ||
| Peristaltic pump | Rainin, Woburn, MA | 2-channel Dinamax RP-1 | ||
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC Decatur, GA | NeuroCCD-SM | ||
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Linos, Inc., Rochester, NY | |||
| Upright microscope | Olympus Optical Co., Tokyo, Japan | BX61TRF | ||
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG–BX2 | ||
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc., Bowdoin, ME | Custom made | ||
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | ||
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | ||
| Heat filter | Schott Optical Glass, Duryea, PA | KG-1 | ||
| High-Q interference filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ530/50 | ||
| Dichroic mirror | Chroma, Inc., Rockingham, VT | 565 nm (50% transmission) | ||
| Long-pass filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ572LP | ||
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | ||
| Neuroplex | RedShirtImaging, Inc., Decatur, GA | |||
| IDL | ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO | |||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Photonics, KK, Hamamatsu City, Japan | |||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | DT3120K-1 | ||
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | Global Lab Image/2 |
Riferimenti
- Costa, M. a. r. c. e. l. l. o., Furness, J. o. h. n. . B., Llewellyn-Smith, I. J., Johnson, L. e. o. n. a. r. d. . R. . in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
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- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
- Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
