Questo protocollo illustra come voltaggio-sensibile coloranti attivare la registrazione ottica di attività elettrica da intatte le reti neurali, come i plessi della cavia sistema nervoso enterico, con una risoluzione regolabile che va dal singolo cellule gangliari a più circuiti.
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Articolo metodologico
La registrazione ottica di attività elettrica in Guinea-maiale Reti enterici utilizzando tensione sensibile Coloranti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema nervoso enterico (ENS) è un self-contained di rete con funzioni identificate, in grado di eseguire comportamenti complessi in isolamento. Suoi neuroni (10-25 micron di diametro) sono organizzati in plessi che sono confinati ai piani distinti della parete intestinale
Protocollo
Parte 1: preparazione dei tessuti
- I preparativi sottomucosa e plesso mienterico sono isolati da dissezione sequenziale dal piccolo intestino di 150-200g (2-3 settimana di vita) Hartley cavie che sono stati anestetizzati per inalazione isoflurano e decapitato. Dopo l'eutanasia, l'intestino tenue è asportato e il suo contenuto rimosso dal lavaggio del lume con un caldo, soluzione ossigenata. Noi usiamo Medium 199 integrata con 25 HEPES mm, 5 mm NaHCO 3 e 2 mM glutammina, e pH regolato a 7,4 (di cui, d'ora in poi, come M199-DM), che è stato pre-riscaldato a 37 ° C. Tutti gli altri passaggi del protocollo, tuttavia, saranno effettuate a ....
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Discussione
Questo protocollo è stato scritto con due obiettivi in mente. Il primo è quello di persuadere altri investigatori che, grazie ai molti progressi tecnologici degli ultimi dieci anni, la registrazione ottica di attività elettrica con tensione di coloranti sensibili è diventato uno dei più potenti, affidabili e convenienti metodologie per lo studio delle reti neuronali intatto, anzi , potrebbe essere facilmente applicata anche in un laboratorio che ha modeste risorse. Il secondo obiettivo è quello di promuovere il sistem.......
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Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare DA Coulter (CHOP) per averci permesso di usare il suo microscopio 2-fotoni ad acquisire il 2-fotone immagini mostrate all'inizio del video, e H. Takano per aver condiviso con noi la sua competenza tecnica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | Con sali di Earle’s, senza L-Glutamina, Rosso Fenolo e Bicarbonato di Sodio |
| Sylgard | Dow Corning | Kit elastomero siliconico 184 | |
| Pinze per insetti utilizzate per la dissezione | F.S.T. | 26001-30 | |
| Pinze Dumont | F.S.T. | 11203-23 o 11200-33 | |
| Forbici a molla Moria MC19/B Pascheff-Wolff | F.S.T. | 15371-92 | |
| Perforatrici per fissare il tessuto durante l'esperimento | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Collagenasi VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Proteasi IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamina 100X | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Nifedipina | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| Generatore di stimoli a 4 canali | Multi Channel System MCS GmbH | Serie 2000 | |
| Pompa peristaltica | Rainin | Dinamax RP-1 a 2 canali | |
| Telecamera ad alta velocità | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Demagnificatore 1:10 / lente di rilè | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| Microscopio verticale | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| Stadio fisso Gibraltar con traslatore motorizzato X-Y | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG--BX2 | |
| Elettrodi matrice lineari | FHC, Inc. | Fatti su misura | |
| Tavolo con isolamento attivo dalle vibrazioni | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| Alimentatore stabilizzato a retroazione con ripple ultra-basso | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| Filtro termico | Schott AG | KG-1 | |
| Filtro interferenziale ad alta qualità | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| Specchio dicromatico | Chroma Inc. | 565 nm (50% di trasmissione) | |
| Filtro passa-alto | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| Paraventi acustici | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| Telecamera CCD ad alta risoluzione, con relativo controllore | Hamamatsu Corp. | ||
| Scheda di acquisizione per telecamera ad alta risoluzione | Data Translation | DT3120K-1 | |
| Software di acquisizione per telecamera ad alta risoluzione | Data Translation | Global Lab Image/2 |
Riferimenti
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell....
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Ristampe e permessi
