A gravação óptica de atividade elétrica na Guiné-porco Networks Enteric usando Tensão sensível Corantes
Summary
Este protocolo ilustra como sensíveis à voltagem corantes permitir a gravação ótica da atividade elétrica de redes neurais intactos, como os plexos do cobaia sistema nervoso entérico, com uma resolução ajustável que varia de single-células ganglionares para multi-circuitos.
Abstract
O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede independente com funções identificadas, capaz de executar comportamentos complexos em isolamento. Seus neurônios (10 a 25 m de diâmetro) são arranjados em plexos que se limitam a planos distintos da parede do intestino<sup> 1</sup>; Do plexo mioentérico podem ser encontrados entre as camadas musculares longitudinal e circular, eo plexo submucoso entre a camada muscular circular e da mucosa. Uma vez que os sistemas efetores para estes plexos (transporte de epitélio, as células endócrinas, elementos imunológico, vasos sanguíneos e músculo liso) também estão contidos dentro da parede do intestino, semi-intactas preparações podem ser dissecados que preservam os componentes individuais de diferentes vias reflexas. O comportamento dos sistemas efetores é controlado pelo plexos submucoso e mioentérico atuando em conjunto. Portanto, o conhecimento detalhado das interações sinápticas dentro e entre os gânglios, e de comunicação entre os plexos, é essencial para a compreensão da função gastrointestinal normal. A ENS, como um sistema nervoso intacto, é um modelo único experimental em que se pode correlacionar eventos moleculares e celulares com o comportamento elétrico da rede neuronal e suas saídas fisiológicas. Por causa da organização quase-bidimensional de sua plexos, a ENS é particularmente adequado para o estudo de redes neurais usando vários sites técnicas de gravação óptica que empregam corantes sensíveis à voltagem<sup> 2,7,8,9</sup>. Vamos ilustrar aqui o uso de um relativamente novo naphthylstyryl-piridínio corante (di-4-ANEPPDHQ)<sup> 3</sup> Que oferece múltiplas vantagens sobre seus antecessores, incluindo fototoxicidade muito baixa, baixa taxa de internalização, e estabilidade química notável. Quando usado em conjunto com uma câmera que permite sub-milissegundo tempo de resolução, este corante nos permite monitorar a atividade elétrica de todos os neurônios no campo de visão com uma resolução máxima espacial de ~ 2,5 mM-aumento de 100X. Com menor ampliação (10X ou 20X), o sacrifício de uma única célula de resolução é compensada por um ganho em perspectiva, revelando a complexidade do circuito inter-ganglionares.
Protocol
Discussion
Este protocolo foi escrito com dois objetivos em mente. O primeiro é convencer outros investigadores que, graças aos avanços tecnológicos muitas da década passada, a gravação ótica da atividade elétrica utilizando corantes sensíveis à tensão tornou-se um dos mais poderosos, metodologias confiáveis e acessíveis para o estudo de redes neuronais intacta, na verdade , poderia ser facilmente implementado, mesmo em um laboratório com recursos modestos. O segundo objetivo é promover o sistema nervoso ent?…
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer DA Coulter (CHOP) por nos permitir usar seu microscópio dois-fotão para adquirir as imagens 2-fótons mostrada no início do vídeo, e H. Takano por compartilhar conosco seus conhecimentos técnicos.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Medium 199 | Sigma, St. Louis, MO | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate | |
| Sylgard | Dow Corning Corp., Midland, MI | 184 silicone elastomer kit | ||
| Insect pins used for dissection | F.S.T., Foster City, CA | 26001-30 | ||
| Dumont forceps | F.S.T., Foster City, CA | 11203-23 or 11200-33 | ||
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T., Foster City, CA | 15371-92 | ||
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp., Shizuoka, Japan | Seirin Spinex | ||
| Collagenase VII | Sigma, St. Louis, MO | C0773 | ||
| Protease IX | Sigma, St. Louis, MO | P6141 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Carlsbad, CA | 10439-016 | ||
| PenStrep | GIBCO, BRL | 15140 | ||
| L-Glutamine 100X | GIBCO, BRL | 25030 | ||
| Nifedipine | Sigma, St. Louis, MO | |||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Eugene, OR | D36802 | ||
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany | 2000 Series | ||
| Peristaltic pump | Rainin, Woburn, MA | 2-channel Dinamax RP-1 | ||
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC Decatur, GA | NeuroCCD-SM | ||
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Linos, Inc., Rochester, NY | |||
| Upright microscope | Olympus Optical Co., Tokyo, Japan | BX61TRF | ||
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG–BX2 | ||
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc., Bowdoin, ME | Custom made | ||
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | ||
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | ||
| Heat filter | Schott Optical Glass, Duryea, PA | KG-1 | ||
| High-Q interference filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ530/50 | ||
| Dichroic mirror | Chroma, Inc., Rockingham, VT | 565 nm (50% transmission) | ||
| Long-pass filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ572LP | ||
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | ||
| Neuroplex | RedShirtImaging, Inc., Decatur, GA | |||
| IDL | ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO | |||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Photonics, KK, Hamamatsu City, Japan | |||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | DT3120K-1 | ||
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | Global Lab Image/2 |
Riferimenti
- Costa, M. a. r. c. e. l. l. o., Furness, J. o. h. n. . B., Llewellyn-Smith, I. J., Johnson, L. e. o. n. a. r. d. . R. . in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
- Salzberg, B. M., Barker, J., McKelvy, J. Current Methods in Cellular Neurobiology. , 139-139 (1983).
- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
- Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
