Grabación óptica de la actividad eléctrica en el conejillo de Indias Redes entérica con tintes sensibles al voltaje
Summary
Este protocolo se ilustra cómo los tintes sensibles al voltaje activar la grabación óptica de la actividad eléctrica de las redes neuronales intactos como los plexos de la cobaya sistema nervioso entérico, con una resolución ajustable que va desde una sola de las células ganglionares de varios circuitos.
Abstract
El sistema nervioso entérico (SNE) es una red independiente con funciones definidas, capaces de realizar conductas complejas de forma aislada. Sus neuronas (10 a 25 micras de diámetro) están dispuestas en plexos que se limitan a distintos planos de la pared intestinal<sup> 1</sup>, El plexo mientérico se encuentran entre las capas musculares longitudinales y circulares, y de la submucosa del plexo entre la capa de músculo circular y la mucosa. Ya que los sistemas efectores de estos plexos (transporte de epitelio, células endocrinas, elementos inmunes, los vasos sanguíneos y el músculo liso) también se encuentran dentro de la pared intestinal, semi-intacta preparaciones pueden ser disecados que preservar los componentes individuales de las diferentes vías de reflejos. El comportamiento de los sistemas efectores está controlado por los plexos submucoso y mientérico actúan en concierto. Por lo tanto, un conocimiento detallado de las interacciones sinápticas entre y dentro de los ganglios, y de la comunicación entre los plexos, es esencial para la comprensión de la función gastrointestinal normal. La ENS, como un sistema nervioso intacto, es un modelo único de experimentación en el que se puede correlacionar los eventos moleculares y celulares con el comportamiento eléctrico de la red neuronal y sus resultados fisiológicos. Debido a la organización cuasi-bidimensional de sus plexos, la ENS es especialmente adecuado para el estudio de las redes neuronales utilizando múltiples técnicas del sitio de grabación óptica que emplean tintes sensibles al voltaje<sup> 2,7,8,9</sup>. Vamos a ilustrar aquí el uso de un relativamente nuevo naphthylstyryl-piridinio tinte (di-4-ANEPPDHQ)<sup> 3</sup> Que ofrece múltiples ventajas sobre sus predecesores, incluyendo fototoxicidad muy baja, baja tasa de internalización, y la estabilidad química notable. Cuando se utiliza junto con una cámara que permite sub-milisegundos de tiempo de resolución, este medio de contraste nos permite monitorear la actividad eléctrica de todas las neuronas en el campo de visión con una resolución máxima espacial de ~ 2.5 micras, con un aumento de 100X. A un menor aumento (10X o 20X), el sacrificio de una sola célula de resolución se ve compensado por un aumento en la perspectiva, revelando la complejidad de los circuitos inter-ganglionares.
Protocol
Discussion
Este protocolo ha sido escrito con dos objetivos en mente. El primero es el de persuadir a otros investigadores que, gracias a los muchos avances tecnológicos de la última década, la grabación óptica de la actividad eléctrica usando tintes sensibles al voltaje se ha convertido en uno de los más poderosos, metodologías confiables y asequibles para el estudio de las redes neuronales intactos y, de hecho , podría ser fácilmente aplicado incluso en un laboratorio con recursos modestos. El segundo objetivo es promo…
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a DA Coulter (CHOP) por permitirnos usar sus dos fotones microscopio para adquirir las imágenes de 2 fotones que aparece al principio del video, y H. Takano por compartir con nosotros su experiencia técnica.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Medium 199 | Sigma, St. Louis, MO | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate | |
| Sylgard | Dow Corning Corp., Midland, MI | 184 silicone elastomer kit | ||
| Insect pins used for dissection | F.S.T., Foster City, CA | 26001-30 | ||
| Dumont forceps | F.S.T., Foster City, CA | 11203-23 or 11200-33 | ||
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T., Foster City, CA | 15371-92 | ||
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp., Shizuoka, Japan | Seirin Spinex | ||
| Collagenase VII | Sigma, St. Louis, MO | C0773 | ||
| Protease IX | Sigma, St. Louis, MO | P6141 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Carlsbad, CA | 10439-016 | ||
| PenStrep | GIBCO, BRL | 15140 | ||
| L-Glutamine 100X | GIBCO, BRL | 25030 | ||
| Nifedipine | Sigma, St. Louis, MO | |||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Eugene, OR | D36802 | ||
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany | 2000 Series | ||
| Peristaltic pump | Rainin, Woburn, MA | 2-channel Dinamax RP-1 | ||
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC Decatur, GA | NeuroCCD-SM | ||
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Linos, Inc., Rochester, NY | |||
| Upright microscope | Olympus Optical Co., Tokyo, Japan | BX61TRF | ||
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG–BX2 | ||
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc., Bowdoin, ME | Custom made | ||
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | ||
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | ||
| Heat filter | Schott Optical Glass, Duryea, PA | KG-1 | ||
| High-Q interference filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ530/50 | ||
| Dichroic mirror | Chroma, Inc., Rockingham, VT | 565 nm (50% transmission) | ||
| Long-pass filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ572LP | ||
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | ||
| Neuroplex | RedShirtImaging, Inc., Decatur, GA | |||
| IDL | ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO | |||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Photonics, KK, Hamamatsu City, Japan | |||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | DT3120K-1 | ||
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | Global Lab Image/2 |
Riferimenti
- Costa, M. a. r. c. e. l. l. o., Furness, J. o. h. n. . B., Llewellyn-Smith, I. J., Johnson, L. e. o. n. a. r. d. . R. . in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
- Salzberg, B. M., Barker, J., McKelvy, J. Current Methods in Cellular Neurobiology. , 139-139 (1983).
- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
- Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
