光退色後二光子蛍光回復を経由して拡散係数の測定
Summary
この記事では、光退色後の多光子蛍光の回復を使用して拡散係数を測定するための手順を説明します。我々は、サンプルへの光路に沿ってレーザーを合わせ、適切な実験パラメータを決定することによって開始されます、その後の生成を続行し、最終的にフィッティング蛍光回復曲線。
Abstract
光退色後のマルチ蛍光回復は、高分子の拡散係数を（または類似のトランスポートパラメータ）を測定するために使用する顕微鏡技術である、との両方に適用することができます。<em> in vitroで</em>と<em> in vivoで</em>生物系。光退色後のマルチ蛍光回復は、ビームを減衰し、photobleached分子を置換するための関心のびまん性の領域の外側から、まだ、蛍光分子などの蛍光をモニターする、強力なレーザーフラッシュを使用して、蛍光試料内に関心領域を退色によって実行されます。我々は、ポッケルスセル（レーザー変調器）を介して、サンプルへのレーザースキャンボックスと対物レンズを介して光路に沿ってレーザービームを調整することで、私たちのデモを開始します。簡単にするために、我々は、水性蛍光色素のサンプルを使用します。私たちは、その後、適切な実験を含めて我々のサンプルのパラメータ、モニターや漂白力、漂白剤の持続時間、ビン幅（フォトンカウンティング用）、および蛍光回復時間を決定します。次に、我々は、回復曲線、主に強化されたスループットは、LabVIEW（ナショナルインスツルメンツ、オースティン、テキサス州）を経由して自動化できるプロセスをとるための手順を説明します。最後に、拡散係数は、MATLAB（Mathworks社、ネイティック、マサチューセッツ州）などのソフトウェアを使用して容易にプログラム可能な最小自乗法のアルゴリズムを使用して、適切な数学モデルにリカバリデータをフィッティングによって決定されます。
Protocol
Discussion
光退色後の多光子蛍光回復の力は、3次元分解能で厚さのサンプルを調査する能力にあります。 1990年代の開発以来、MP – FRAPは細胞体、 生体外で厚い組織切片、 および in vivo組織と間質への拡散係数を（または類似のトランスポートパラメータ）を決定するために使用されています。この記事では、MP – FRAP実験、ならびに、実験パラメータの設定データを取得し、回復曲線…
Acknowledgements
この作業はホープScholarの賞の防衛時代の部（第W81XWH – 05から0396まで）とエドワードB.ブラウンIIIに医歯薬学総合研究賞のPewの学者によって賄われていた。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ti:sapphire laser | Spectra Physics | Mai Tai | ||
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | ||
| Laser Scanning Microscope | Olympus | Fluoview | ||
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technologies | 670 DCSX-2P | ||
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | ||
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | ||
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | ||
| FITC-BSA | Invitrogen | — |
Riferimenti
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. r. o. w. n., Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
