Undecalcified Подготовка костей для гистологии, гистоморфометрии и флуорохромами Анализ
Summary
Undecalcified гистологии костей дает важную информацию для различных клинических и научных исследований. Это технически сложно, особенно крупные экземпляры размером. В этом видео показан процесс получения хороших разделы качества и демонстрирует технические трудности и методы их преодоления.
Abstract
Undecalcified гистологии костей показывает, микро-архитектуру кости. Он показывает, как минерализованные и клеточных компонентов кости, что обеспечивает жизненно важную информацию об обороте кости или образования и резорбции кости. Это имеет огромное значение в различных клинических и научных исследований. Она дает прекрасные образы 1 и позволяет такие методы, как флуорохромом оценки и гистоморфометрии 2. Флуорохромами анализ техники, где флуоресцентные красители, которые связываются с кальцием вводятся в определенный момент времени, что позволяет количественно оценить количество минерализации в то время. Гистоморфометрии это процесс количественного кости на микроскопическом уровне.
Выполнение undecalcified гистологии костей является технически сложной задачей, особенно в крупных особей размера. Это требует изменения техники от используемых в стандартных парафин гистологии. В этом видео показан процесс получения хороших разделы качества и демонстрирует технические трудности и методы их преодоления. Подготовка образца, фиксации и обработки достигаются при аналогично других мягких тканей, однако из-за плотности и нижней проницаемость костей значительно больше времени, фиксации и обработки пояс требуется, часто занимает несколько недель. Вложение достигается с помощью поддержки среду с таким же или близким твердость и плотность кости, такие как метакрилат основе смол, но в отличие от проникновения парафина и вложение, это необратимый шаг. Секционирование может быть достигнуто путем измельчения, которая производит толстый раздел, который является оптимальным для исследования, такие как флуорохромом анализа. Лучше всего это достигается с помощью алмаза лезвие на macrotome. Кроме того, тонкие разделы могут быть произведены для световой микроскопии и это достигается с помощью саней микротома с очень острым лезвием. Сани микротома обеспечивает дополнительную прочность и устойчивость, необходимые для больших, жестких блоков. Смола срезы могут быть окрашены в различные пятна, которые демонстрируются.
Protocol
Acknowledgements
Авторы выражают признательность за помощь г-жа Сью Коннелл для нее опыт в вложение смолы и г-жи Стефании гробниц для нее лабораторной экспертизы. Авторы хотели бы поблагодарить профессора Франка Kandziora и д-р Мари-Анн Polboth за их советы.
Materials
- 10% Normal Buffered Formalin, Ethanol, Xylene and Butanol acid
All histology grade, sulfur free.
Grale Scientific Pty Ltd.
http://www.grale.com.au
- Peel away, plastic moulds
Grale Scientific
- SUPERFROST PLUS Microscope slides
Lomb Scientific Pty Ltd.
http://www.lomb.com.au
- GlycolMethacrylate Technovit 7100
Heraeus Kulzer
http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm - Backing Block Resin- Technovit 3040 Histo block
Heraeus Kulzer
(Reagents from Grale Scientific)
Goldner’s Trichrome stain
1. Weigert’s iron hemotoxylin (DeGroat)
| a) Hemotoxylin solution | |
| Hemotoxylin | 1g |
| Absolute Alcohol | 100mL |
| b) Iron Solution | |
| 30% aqueous ferric chloride | 4mL |
| Hydrochloric acid (concentrated) | 1mL |
| distilled Water | 95mL |
Filtered and added to equal volume of hemotoxylin immediately before stain used.
2. Ponceau-fuchsin-azophloxin stock solutions
| a) Ponceau de xylidine solution | |
| Ponceau de xylidine | 0.75g |
| acid fuchsion | 0.25g |
| Acetic Acid | 1mL |
| mix, and add distilled water (100mL) | |
| b) azophloxin solution | |
| Azophloxin | 0.5g |
| Acetic acid | 0.6mL |
| mix, and add distilled water (100mL) | |
| c) Final working stain solution | |
| Ponceau-fuchsin solution | 5-10mL |
| Azophloxin | 2mL |
| 0.2% acetic acid solution | 88mL |
3. Light Green Solution
| Light Green | 1g |
| acetic acid | 1mL |
| Mix, and add distilled water (500mL) | |
4. Phophomolybdic acid-Orange G solution
| Phosphomolybdic acid | 3g |
| Orange G | 2g |
| Dissolve in 500mL of distilled water and add crystal thymol. | |
Von Kossa Stain
| 1% aqueous silver nitrate |
| 2.5% sodium thiosulfate |
| 1% safranin O |
Alcian blue stain
| Alcian blue 8GX | 1g |
| 3% acetic acid solution | 100mL |
Hemotoxylin and Eosin stain
| a)Harris’s hemotoxylin | |
| Hemotoxylin | 2.5g |
| Absolute alcohol | 25mL |
| Potassium Alum | 50g |
| distilled water | 500mL |
| mercuric oxide | 1.25g OR |
| Sodium iodate | 0.5g |
| Glacial acetic acid | 20mL |
| b) Eosin solution | |
| Commercially produced Eosin was used. | |
All stain dye powders are Gurr dye powders.
All reagents are analytical reagents, and not Lab reagents
Fluorochromes
Manufacturer |
Fluorochrome | Catalogue Number |
| Sigma-Aldrich, Sydney | Calcein Green | C0875 |
| Sigma-Aldrich, Sydney | Alizarin Complexone | A3882 |
| Intervet Australia, Victoria | Oxytetracycline (off the shelf antimicrobial drug) |
Tradename; Engemycin 100 |
Riferimenti
- Kerr, J. . Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).
- Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).
- An, Y. H., Martin, K. l. . Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).
- Bancroft, J. D., Gamble, M. . Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).
