Summary
Ганглиозные клетки сетчатки передают зрительную информацию от глаза к мозгу с последовательностями потенциалов действия. Здесь показано, как для записи потенциалов действия одиночных клеток ганглия
Abstract
Информация о визуальном мире передается в мозг по последовательности потенциалов действия в ганглиозных клеток сетчатки аксонов, составляющих зрительный нерв.
Protocol
Часть I: Производство вольфрама-в-Стекло Электроды
- Графитовым кольцом помещается в стакан заполненный концентрированным раствором нитрата натрия (0.71g/mL) и гидроксид калия (0.34g/mL), растворенные в воде 1, и стакан помещают под швейное руку изменение швейной машины .
- Вольфрам провод (0,5 мм диаметром 6 см длины), приклеенный к швейной руку так, чтобы он частично погруженный (1-2см) в растворе.
- 2В применяются по всей вольфрамовой проволоки, присоединяя положительные привести к швейной руку и привести к отрицательным графитовым кольцом.
- Швейная машина включена и вольфрамовой проволоки погружают в раствор повторно со скоростью ~ 4 Гц в течение 2 мин, который электролитическим гравирует металла острия.
- Травление проволоки помещается на ручной микроманипулятора и точки выровнены при микроскопическом руководства (40-кратном увеличении) с валом стеклянную пипетку (0,25 мм OD, 0.175mm ID) тянутся к наконечник 1 мм со стеклянной съемника. Чтобы предотвратить смещение во проволоки вставки стекла временно закреплен на столике микроскопа с замазкой.
- Провод тщательно передовых в unpulled конце стекла, в шахту, и через 1 мкм открытия небольшой кусочек стекла видно разорвать чаевые в видео, что указывает на плотную посадку из вольфрама в стекле. Проволока должна распространяться по всему 5-10мм за наконечник для записи оптических крысы волокна.
- Цианоакрилат применяется к unpulled конце стекла и после затвердевания электрическое сопротивление измеряется, где 1МОм электродов как правило, работают лучше всего.
Часть II: стереотаксической установки и записи Спайк поезд
- Система стимулов дисплей показано на видео, наряду с стереотаксического аппарата и Microdrive для позиционирования и опускания электродов в мозг.
- Для выполнения сетчатки поезд шип записи крысы под наркозом, а затем парализован. Стандартные процедуры (не показаны) используются для хирургической вставки бедренную вену канюлю для доставки лекарств и трахеи (Y-трубка) канюля для искусственной вентиляции легких во время паралича. Эксперименты терминал для животных.
- После подготовительных процедур, животное находится на обогрев одеяло и голова фиксируется в стереотаксической позиции, как это определено в головном мозге крыс атлас 2, с уха и зубов баров.
- Ректальный зонд вводится, который управляет отоплением одеяло через теплокровных блок управления, который поддерживает температуру тела при температуре 37 ° C.
- Металл иглы используются как мера приводит к ЭКГ и монитором частоты сердца.
- Кожа открылся в верхней части черепа и пересечения черепа пластинами (брегмы) подвергается. Специально разработанный перекладину кадра установлен на месте, круг отмечается черепа вокруг Бегма через отверстие в перекладину, и перекладины временно удалены.
- Стереотаксической системы калибровки, позиционируя руководство иглу над брегмы. 5-мм отверстие просверленное в череп в отмеченных месте и кости удаляют, подвергая головной мозг. Тонкие кольца шпатлевка, расположенных вокруг отверстие в черепе, чтобы сформировать уплотнение вокруг отверстия в перекладину, который сбрасывается на место.
- Если животное было на стабильном плоскости анестезии на некоторое время, он вводится с паралитическим в целях предотвращения движения глаз во время сбора данных. После остановки дыхания животного искусственной вентиляции легких. Пользовательскую программу треков вентиляции и физиологические параметры в течение всего эксперимента и сообщает экспериментатору, если компенсационные меры необходимы какие-либо параметры должны выйти на улицу нормального уровня.
- Руководство игла backloaded с вольфрамовым электродом и опустил в мозг. После проникновения мозга перекладины отверстие заполняется агара (не показаны), а также сборка Microdrive крепится к перекладине для механической стабильности. Вольфрамовый электрод, затем медленно продвигались (2μm/sec) из руководства иглы до кончика составляет около 8-9мм ниже черепа, где зрительного перекреста находится.
- Спайк поездов принадлежащих ганглиозных клеток сетчатки идентифицируются по их реакции на визуальные вход. После изоляции одного оптического волокна рецептивного поля записаны клетка переходит в визуальное пространство и его свойства ответ характеризуются дрейфующих решетки или других визуальных образов, представляющих интерес. Стабильность системы позволяет единичные записи нескольких часов 3.
Материалы
Взрослый Браун-Норвегия крыс (250-400г) были куплены у коммерческих поставщиков и размещается под регулируемым (12/12) светлый / темный цикла. Анестезия индуцировали внутрибрюшинного введения кетамина гидрохлорид и ксилазина (70 и 2 мг / кг соответственно, Генри Шайн Inc) и поддерживается на протяжении всего экспериментаiment с внутривенной инфузии кетамина и ксилазина (30 и 1 мг / кг / ч), смешанного с раствором декстрозы, физиологическим раствором, и gallamine triethiodide (40 мг / кг / ч, Фишер Inc) через катетер (диаметр 0,13 мм, мелкие детали Inc ) в правую бедренную вену. Gallamine входит в смесь, чтобы парализовать движение глаз. Инфузии скорость насоса (WPI Inc) была скорректирована по мере необходимости для поддержания стабильной плоскости анестезии по оценке сердечного ритма и вариабельности артериального давления. После параличи, животное искусственной вентиляции легких (Harvard аппарата, модель 683) через трахеи канюли в 60-80 вдохов / мин (2CC объема), со скоростью с корректировками, необходимыми для поддержания в конце выдоха CO 2 измеряется в линию капнометра (Novametrix Inc, модель 710Sp) на 30%. Температура тела, регулируется с помощью системы управления теплокровных одеяло (Harvard Аппарат Inc). Температура тела, в конце выдоха CO 2, частоты сердечных сокращений и артериального давления постоянно контролируется в течение всего эксперимента по программе LabVIEW. Визуальные стимулы были представлены на Sony Multiscan 17е ЭЛТ-монитор (средняя яркость 30 кд / м 2), работающих на частоте 100 Гц с разрешением 800x600 пикселей. Сбор данных и вывод на монитор контролировались с помощью пользовательских программ, написанных в Matlab и LabView в сочетании с процессором видеоизображения (Cambridge Research Systems Inc, биты + +) и психофизики Toolbox 4. Животных рассматривается стимул дисплей (40,4 х 30,2 см) на расстоянии 16,5 см через контактные линзы (Глазные Instruments Inc), и офтальмологического раствора был применен периодически во время эксперимента, чтобы сохранить глаза влажными. Поля зрения доступных для стимуляции было развернуто с помощью обратного монтажа животное в стереотаксического аппарата (Stoelting Co) повышенных 14 см над поверхностью плавающей таблицы (TMC Inc) и установки монитора на специально разработанных сани, движущаяся по таблице вместе ± 100 градусов дуги вокруг носа. Это при условии, перемещаемый поле дисплея, что расширенные 60-градусов выше, и 35-градусов ниже уровня глаз и ± 42-градусов в сторону от центра монитора. Вольфрам electodes были сфабрикованы с проволокой полученные из мелких деталей Inc и пользовательские боросиликатного стекла, полученного из Фридриха и Диммок Инк стандартных micropippete съемник (Саттер инструменты, модель P-97) был использован для формы стеклянным наконечником. Тестер сопротивления электрод был приобретен у Бака-Electronics. Электроды были выдвинуты с моторизованным Microdrive системы (Newport Inc, StepperMike). Электрокардиограмма и зрительного нерва сигналы после усиления фильтруется с высоким входным сопротивлением многоэлектродной усилителя (FHC Inc, X-Cell 3х4). Сердце бьется были обнаружены с окна дискриминатора (WPI Inc, модель 121). Нервные потенциалы действия были обнаружены и временными метками с 0,1 мс резолюции цифровой шип дискриминатора (FHC Inc, APM). Шип дискриминатор был закрытый от запускающего сигнала от процессора видео изображения так, чтобы шип времена были привязаны к стимулу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оптические волокна записи привлекательным подхода к решению вопросов о экспериментальные сетчатки кодирования и передачи информации, которые требуют неповрежденный глаз. Кроме того, сигнализации свойства обоих глазах могут быть изучены практически в том же физиологическом состоянии, если электрод расположен в зрительных нервов или тракта, где деятельность перекрестный и неперекрестный волокон зрительного нерва могут быть записаны с помощью одного проникновения электрода. Оптические волокна записи распространены в кота, но не в других популярных моделей животных, используемых в исследовании зрения, такие как грызуны, возможно, по причине их малого размера. Мы постарались различных коммерческих электродов подобного сопротивления и материальных, ни одна из которых были успешными в собирание отдельного вида деятельности волокна в крысу, не говоря уже о записи его в течение нескольких часов, как наши электроды могут. Это означает, что особенности геометрии наши электроды, которые имеют длинный, острый кончик, а не широким тупым кончиком типичные коммерческие, имеет важное значение для надежного и стабильного изоляции аксонов ганглиозных клеток поездов шип. В дополнение к показывающий, как изготовить эти электроды, мы проиллюстрируем наш специально разработанный стереотаксической системы в естественных визуальных нейрофизиологических исследований. Система построена для защиты высокое сопротивление микроэлектрода от экологической вибрации и электромагнитных шумов. Это очень важно для записи малых потенциалов действия производятся по аксонам (по сравнению с клеточных тел) в течение длительного периода времени, особенно с компьютерного монитора расположены неподалеку. Он делает это с исключительной стабильностью и отношение сигнал-шум, с типичными время записи одного часа или более, а уровень шума порядка десятков микровольт. Эти особенности делают установку особенно полезны для зрения исследователей, направленные на запись в естественных условиях из нервных волокон сетчатки или других участках мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в Бостонском университете.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Дан зеленый для обеспечения технического вклада в развитие этих экспериментальных методик. Эта работа была поддержана NIH Грант R01-EY016849A и семьи Смит Новая премия следователь.
References
- Levick, W. R.
Another tungsten microelectrode. Med Biol Eng. 10 (4), 510-515 (1972). - Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Fourth Edition, Academic Press. London, UK. (1998).
- Freeman, D. K., Heine, W. F., Passaglia, C. L. The maintained discharge of rat retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 25 (4), 535-548 (2008).
- Brainard, D. H.
The psychophysics toolbox. Spat Vis. 10, 433-436 (1997).