Многофотонная микроскопия позволяет управлять фотонами малых энергий с глубоким проникновением оптических и снижения фототоксичности. Мы описываем использование этой технологии для живых маркировки ячейку в данио эмбрионов. Этот протокол можно легко адаптировать для фото-индукции различных световых проблематику молекул.
Фотоактивация целевых соединений в живом организме оказалось ценным подход к исследованию различных биологических процессов, таких как эмбрионального развития, клеточной сигнализации и взрослых физиологии. В этом отношении использование многофотонной микроскопии позволяет количественные фотоактивации данной свет реагировать агент в глубоких тканей в одной резолюции клетки. Как эмбрионов данио оптически прозрачны, их развитие можно наблюдать в естественных условиях. Эти черты делают данио совершенный организм модели для управления деятельностью различных химических веществ и белков сфокусированный свет. Здесь мы опишем использование двух-фотонной микроскопии, чтобы побудить активации химически клетке флуоресцеина, который, в свою очередь, позволяет проследить судьбу клетки в живых эмбрионов данио. Мы используем эмбрионов выражения жить генетических ориентир (GFP), чтобы найти и точно ориентировать любой клетки интерес. Эта процедура может быть так же использован для точного света индуцированной активации белков, гормонов, малых молекул и других клетках соединений.
Фото-активируемые соединения молекул, функция которого состоит в маске, пока они не освещены с определенной длиной волны (как правило, УФ), вызывающие фотохимические реакции, которая преобразует молекулы в биологически или химически активном состоянии. Эти зонды обеспечивают очень мо?…
Выражаем благодарность Женя Бродского для фигурного графика; Вячеслав Кальченко, Дуглас Лутц, и Леонид Ройтман о технической консультации и помощь в двухфотонного uncaging; Мааян тахор и Сулиман Elsadin в технической помощи; Уве Strahle за любезно предоставленные neurogenin1 линии репортер и Амос Гутник комментариев к этой рукописи. Исследования в лаборатории Levkowitz поддерживается германо-израильского фонда (грант № 183/2007); Израиль научного фонда (грант № 928/08) и Харриет и Марсель Деккер Foundation. GL является Сотрудник развития Тауро Карьера кафедрой биомедицинских исследований.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
Fast Red | Roche | 11496549001 |