Två-foton-Based Fotoaktiveringen i Live Zebrafish embryon
Summary
Multiphoton mikroskopi tillåter kontroll av låg energi fotoner med djup optisk penetration och minskad fototoxicitet. Vi beskriver användningen av denna teknik för levande cell märkning i zebrafisk embryon. Detta protokoll kan lätt anpassas för foto-induktion av olika ljus-känslig molekyler.
Abstract
Fotoaktivering av mål föreningar i en levande organism har visat sig vara en värdefull metod för att undersöka olika biologiska processer som embryonal utveckling, cellulär signalering och vuxna fysiologi. I detta avseende möjliggör användning av multi-foton mikroskopi kvantitativa fotoaktivering av ett visst ljus lyhörd agent i djupa vävnader i en enda cell upplösning. Som zebrafisk embryon är optiskt transparenta, kan deras utveckling följas in vivo. Dessa egenskaper gör zebrafisk en perfekt modell organism för att kontrollera aktiviteten hos en mängd olika kemiska ämnen och proteiner med fokuserat ljus. Här beskriver vi användandet av två-photon mikroskopi för att framkalla en aktivering av kemiskt bur fluorescein, vilket i sin tur ger oss möjlighet att följa cellens öde i levande zebrafisk embryon. Vi använder embryon som uttrycker en levande genetisk landmärke (GFP) för att lokalisera och exakt rikta alla celler av intresse. Detta förfarande kan vara lika användas för exakta ljus inducerad aktivering av proteiner, hormoner, små molekyler och andra bur föreningar.
Protocol
Discussion
Foto-aktiveras genom föreningar är molekyler vars funktion är maskerad tills de belyses med en viss våglängd (oftast UV), förmå en fotokemisk reaktion som omvandlar molekyler i ett biologiskt eller kemiskt aktivt läge. Dessa sonder ger mycket kraftfulla verktyg i cellbiologi forskning, eftersom aktiveringen kan justeras tidsmässigt och rumsligt genom att begränsa sin exponering för ljus.
Den betydande fördel av multi-foton mikroskopi är dess relativt djup optiska inträngning oc…
Acknowledgements
Tack till Genia Brodsky för figur grafik, Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz och Leonid Roitman för teknisk rådgivning och hjälp med de två-photon uncaging, Maayan Tahor och Suliman Elsadin för tekniskt stöd, Uwe Stråhle för vänligt ge neurogenin1 reportern linje och Amos Gutnick för kommentarer till detta manuskript. Forskningen inom Levkowitz labbet stöds av den tysk-israeliska Foundation (licensnummer 183/2007), Israel Science Foundation (licensnummer 928/08) och Harriet & Marcel Dekker Foundation. GL är en sittande i Tauro Career Development professur i biomedicinsk forskning.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes | |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma | A9539 | ||
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW100F-6 | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV820 | ||
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma | 22290-9 | ||
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | ||
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche | 11426338910 | ||
| Fast Red | Roche | 11496549001 |
Riferimenti
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , (1995).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Staudt, N., Houart, C. The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization. PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Bulina, M. E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).
- Adams, S. R., Tsien, R. Y. Controlling cell chemistry with caged compounds. Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).
- Wieboldt, R. Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).
- Marque, J. J. Using caged neurotransmitters. Nature. 337, 583-584 (1989).
- Zucker, R. Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2. Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).
- Neveu, P. A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos. Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).
- Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos. Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat Genet. 28, 317-325 (2001).
