移植绿色荧光蛋白表达对视网膜和大脑发育的实时成像嵌合斑马鱼胚胎的卵裂球
Summary
我们展示了协议，实时成像胚胎发育过程中的细胞行为产生的嵌合斑马鱼的胚胎。
Abstract
在自己的位置和财产广泛胚胎发育过程中细胞的变化。这些变化是受细胞和它们的环境之间的相互作用。嵌合胚胎的遗传背景不同的细胞组成的，是伟大的工具来研究基因介导的细胞 – 细胞相互作用。斑马鱼胚胎早期发育阶段的透明度，允许在细胞水平上的组织和器官的形态发生的直接可视。在这里，我们展示了一个协议，以产生在斑马鱼胚胎的嵌合体视网膜和大脑的供体细胞进行实时成像。该协议包括移植针，准备移植绿色荧光蛋白GFP阴性主机，表达捐助卵裂球和捐助现场共聚焦显微镜下的细胞行为的审查。稍作修改，这个协议也可以被用来研究的其他组织和机关在斑马鱼的胚胎发育。使用GFP标签的供体细胞的优点进行了讨论。
Protocol
第1天。制备 1。设置鱼杂交在晚上设置成对杂交斑马鱼。为了防止随机交配前所需的时间，使用分频器分开，在交配磁带的雌性和雄性的鱼。绿色荧光蛋白表达的转基因鱼，用于捐助卵裂球的来源。 pt104转基因株系（邹等 ，2008），用在这里，表达GFP的无所不在EF1启动子的控制下。 GFP的表达，使供体细胞的可视化实时成像。其他表达合适的荧光蛋白的?…
Discussion
在这段视频中，我们展示了一个卵裂球移植的方法来分析在斑马鱼的视网膜和大脑发育。此协议也可以用来分析其他组织和器官的发展，在主机的胚胎捐赠者卵裂球，只需释放到相应的位置。与绿色荧光蛋白分子的标签产量比用荧光染料标记的葡聚糖（何和凯恩1990年）标签的背景清洁。这是因为右旋糖酐染料从死亡的供体细胞的碎片持续更长的时间比绿色荧光蛋白，从而推断成像（卡塔拉…
Acknowledgements
这项研究是由一个国家卫生研究院（NIH）的核心格兰特（5P30EY008098）及以下的资金XW：美国国立卫生研究院批准R01EY016099和研究，以防盲职业发展奖的支持。我们感谢协助共焦成像基拉Lathrop。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5 ¾” Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | ||
| Borosilicate Glass Capillary | WPI (World Precision Instruments, Inc.) | 1B100F-4 | ||
| FluoroDish | WPI | FD35 | ||
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | ||
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | ||
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | ||
| Manual Microsyringe Pump | WPI | MMP | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | ||
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | ||
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | ||
| Agarose | RPI (Research Products International Corp.) | 9012-36-6 | ||
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 |
E3 egg water:
- 5 mM NaCl
- 0.17 mM KCl
- 0.33 mM CaCl2
- 0.33 mM MgSO4
- 0.1% methylene blue
Riferimenti
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
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Citazione di questo articolo
Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (41), e1924, doi:10.3791/1924 (2010).