Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell'immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico
Summary
Dimostriamo un protocollo per generare embrioni di zebrafish chimerico per vivere comportamento imaging cellulare durante l'embriogenesi.
Abstract
Cellule cambiare ampiamente nelle loro posizioni e proprietà durante l'embriogenesi. Questi cambiamenti sono regolati dalle interazioni tra le cellule e il loro ambiente. Embrioni chimerici, che sono composti da cellule di diverso background genetico, sono grandi strumenti per studiare le interazioni cellula-cellula mediata da geni di interesse. La trasparenza embrionale del pesce zebra in primi stadi di sviluppo permette la visualizzazione diretta della morfogenesi dei tessuti e organi a livello cellulare. Qui, dimostriamo un protocollo per generare retine chimerico e cervelli in embrioni di zebrafish e di eseguire l'imaging dal vivo delle cellule del donatore. Il protocollo riguarda la preparazione di aghi trapianto, il trapianto di GFP che esprimono blastomeri donatore per GFP-negativi padroni di casa, e l'esame del comportamento delle cellule del donatore vivo sotto microscopia confocale. Con lievi modifiche, questo protocollo può essere usato anche per studiare lo sviluppo embrionale di altri tessuti e organi in zebrafish. I vantaggi di usare buone pratiche agricole per le cellule del donatore etichetta vengono anche discussi.
Protocol
Discussion
In questo video, si dimostra un metodo per blastomero trapianto di analizzare lo sviluppo della retina e del cervello in zebrafish. Questo protocollo può essere utilizzato anche per analizzare lo sviluppo di altri organi e tessuti, semplicemente rilasciando il blastomeri donatore di posizioni corrispondenti negli embrioni di accoglienza. L'etichettatura con le molecole GFP produce uno sfondo più pulito rispetto etichettatura con colorante fluorescente coniugato Destrano (Ho e Kane 1990). Questo perché i residui d…
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato da una National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) ei fondi di seguito per XW: NIH Concessione R01EY016099 e della Ricerca per la prevenzione Career Development Award cecità. Ringraziamo Lathrop Kira per l'assistenza nel campo dell'imaging confocale.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5 ¾” Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | ||
| Borosilicate Glass Capillary | WPI (World Precision Instruments, Inc.) | 1B100F-4 | ||
| FluoroDish | WPI | FD35 | ||
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | ||
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | ||
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | ||
| Manual Microsyringe Pump | WPI | MMP | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | ||
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | ||
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | ||
| Agarose | RPI (Research Products International Corp.) | 9012-36-6 | ||
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 |
E3 egg water:
- 5 mM NaCl
- 0.17 mM KCl
- 0.33 mM CaCl2
- 0.33 mM MgSO4
- 0.1% methylene blue
Riferimenti
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
