Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico
Summary
Demonstramos um protocolo para gerar embriões quiméricos zebrafish para o comportamento imagens ao vivo do celular durante a embriogênese.
Abstract
Células mudam extensivamente em seus locais e dos bens durante a embriogênese. Essas alterações são reguladas pelas interações entre as células e seu meio ambiente. Embriões quiméricos, que são compostas de células de fundo genético diferente, são ótimas ferramentas para estudar as interações célula-célula mediada por genes de interesse. A transparência embrionário de zebrafish em fases iniciais de desenvolvimento permite a visualização direta da morfogênese de tecidos e órgãos em nível celular. Aqui, nós demonstramos um protocolo para gerar retinas quimérico e cérebros em embriões de peixe-zebra e para realizar imagens ao vivo das células do doador. O protocolo abrange a preparação de agulhas transplante, o transplante de GFP-expressando blastômeros doadores para GFP-negativos hosts, eo exame do comportamento dos doadores de células sob microscopia confocal ao vivo. Com pequenas modificações, este protocolo também pode ser usado para estudar o desenvolvimento embrionário de outros tecidos e órgãos em peixes-zebra. As vantagens de usar a GFP para as células do doador rótulo também são discutidos.
Protocol
Discussion
Neste vídeo, demonstramos um método para blastômero transplante para analisar o desenvolvimento da retina e do cérebro em zebrafish. Este protocolo também pode ser usado para analisar o desenvolvimento de outros tecidos e órgãos, simplesmente liberando a blastômeros de doadores para os locais correspondentes nos embriões host. A rotulagem com as moléculas de GFP rende um aspirador de fundo do que a marcação com corante fluorescente conjugada Dextran (Ho e Kane, 1990). Isto é porque os restos de tintas Dextr…
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por um dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Core Grant (5P30EY008098) e os fundos a seguir para XW: Grant NIH R01EY016099 e Pesquisa para prevenir a cegueira Prêmio de Desenvolvimento de Carreira. Agradecemos a Lathrop Kira de assistência em imagem confocal.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5 ¾” Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | ||
| Borosilicate Glass Capillary | WPI (World Precision Instruments, Inc.) | 1B100F-4 | ||
| FluoroDish | WPI | FD35 | ||
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | ||
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | ||
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | ||
| Manual Microsyringe Pump | WPI | MMP | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | ||
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | ||
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | ||
| Agarose | RPI (Research Products International Corp.) | 9012-36-6 | ||
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 |
E3 egg water:
- 5 mM NaCl
- 0.17 mM KCl
- 0.33 mM CaCl2
- 0.33 mM MgSO4
- 0.1% methylene blue
Riferimenti
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
