Трансплантация GFP-экспрессирующих бластомеров для живых изображений сетчатки и мозга развития в химерические эмбрионов данио рерио
Summary
Мы демонстрируем протокол для получения химерных эмбрионов данио для живого изображения сотовой поведение во время эмбриогенеза.
Abstract
Клетки изменения широко в местах их расположения и имущества во время эмбриогенеза. Эти изменения регулируется взаимодействие между клетками и окружающей их среды. Химерные эмбрионы, которые состоят из клеток разных генетический фон, большие средства для изучения межклеточных взаимодействий посредничестве генов, представляющих интерес. Эмбриональных прозрачности данио на ранних стадиях развития позволяет прямой визуализации морфогенез тканей и органов на клеточном уровне. Здесь мы демонстрируем протокол для получения химерных сетчатку и мозг в данио эмбрионов и выступать с концертами изображений донорских клеток. Протокол охватывает подготовку трансплантации иглы, трансплантации GFP-экспрессирующих доноров бластомеров на GFP-отрицательный Саваоф, и изучение клетки-донора поведения в живых конфокальной микроскопии. С небольшими изменениями, этот протокол также может быть использован для изучения эмбрионального развития других тканей и органов в данио. Преимущества использования GFP в клетки донора этикетке также обсуждаются.
Protocol
Discussion
В этом видео мы продемонстрируем метод трансплантации бластомеров проанализировать сетчатки и развитие мозга в данио. Этот протокол также может быть использована для анализа развития других тканей и органов просто выпуская доноров бластомеров в соответствующих местах в принимающей…
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH) Core Грант (5P30EY008098) и следующие средства для XW: NIH Грант R01EY016099 и исследований в области профилактики слепоты развития карьеры Award. Мы благодарим Кира Латроп за помощь в конфокальной микроскопии.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5 ¾” Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | ||
| Borosilicate Glass Capillary | WPI (World Precision Instruments, Inc.) | 1B100F-4 | ||
| FluoroDish | WPI | FD35 | ||
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | ||
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | ||
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | ||
| Manual Microsyringe Pump | WPI | MMP | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | ||
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | ||
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | ||
| Agarose | RPI (Research Products International Corp.) | 9012-36-6 | ||
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 |
E3 egg water:
- 5 mM NaCl
- 0.17 mM KCl
- 0.33 mM CaCl2
- 0.33 mM MgSO4
- 0.1% methylene blue
Riferimenti
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
