Transplantation av GFP-uttryckande blastomerer för Live avbildning av näthinnan och hjärnans utveckling hos chimära Zebrafish embryon
Summary
Vi visar ett protokoll för att generera chimär zebrafisk embryon för Bildproduktion cellulära beteende under fosterutvecklingen.
Abstract
Cellerna ändras mycket i deras placering och egendom under fosterutvecklingen. Dessa förändringar regleras av samspelet mellan cellerna och deras omgivning. Chimär embryon, som består av celler med olika genetisk bakgrund, är bra verktyg för att studera cell-cell interaktioner gener av intresse. Den embryonala insyn i zebrafisk i tidiga utvecklingsstadier medger direkt visualisering av morfogenes av vävnader och organ på cellnivå. Här visar vi ett protokoll för att generera chimär näthinnor och hjärna i zebrafisk embryon och att spela live avbildning av givarens celler. Protokollet omfattar beredning av transplantation nålar, transplantation av GFP-uttryckande givare blastomerer att GFP-negativa värdar, och undersökning av givaren cellens beteende under Live konfokalmikroskopi. Med smärre ändringar, kan detta protokoll också användas för att studera embryonala utvecklingen av andra vävnader och organ i zebrafisk. Fördelarna med att använda GFP till celler etiketten donator diskuteras också.
Protocol
Discussion
I denna video visar vi en metod för blastomere transplantation att analysera näthinnan och hjärnans utveckling hos zebrafisk. Detta protokoll kan också användas för att analysera utvecklingen av andra vävnader och organ genom att helt enkelt släppa givaren blastomerer till motsvarande platser i värden embryon. Märkningen med GFP molekyler ger en renare bakgrund än märkning med fluorescerande färg-konjugerade Dextran (Ho och Kane 1990). Detta beror på skräp av dextran färgämnen från döda givare celler …
Acknowledgements
Denna studie stöddes av en National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) och följande medel till XW: NIH Grant R01EY016099 och forskning för att förebygga blindhet Award karriärutveckling. Vi tackar Kira Lathrop för att få hjälp i konfokala avbildning.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5 ¾” Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | ||
| Borosilicate Glass Capillary | WPI (World Precision Instruments, Inc.) | 1B100F-4 | ||
| FluoroDish | WPI | FD35 | ||
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | ||
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | ||
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | ||
| Manual Microsyringe Pump | WPI | MMP | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | ||
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | ||
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | ||
| Agarose | RPI (Research Products International Corp.) | 9012-36-6 | ||
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 |
E3 egg water:
- 5 mM NaCl
- 0.17 mM KCl
- 0.33 mM CaCl2
- 0.33 mM MgSO4
- 0.1% methylene blue
Riferimenti
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
