Immuncytokemiska Analys av mänskliga pluripotenta stamceller med hjälp av en self-made Cytospin Apparater

Summary

Avstängning immuncytokemiska färgning av mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) för cellytan markörer (SSEA-3/SSEA-4) uppnåddes baseras på användning av en self-made cytospin apparater för att skapa ett monolager av celler för observation och kvantifiering.

Abstract

Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) som omfattar mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) är spännande cell källor på grund av deras gränslösa självförnyelse förmåga och sina möjligheter att differentieras till olika celltyper. Den pluripotenta tillstånd hPSCs är normalt bedöms av tekniker såsom qPCR, immuncytokemi, och av andra<em> In vitro</em> Och<em> In vivo</em> Differentiering strategier till flera celltyper. Bland dessa har immuncytokemiska tekniker har utvecklats för rutinmässig karakterisering av den odifferentierade tillstånd hPSCs bygger på analys av kandidat intracellulära och cellytan biomarkörer. Med tanke på att hPSCs växer som kolonier uppstår problem att kvantifiera uttrycket av dessa markörer på individnivå cellnivå på ett rutinmässigt sätt. Flödescytometri analys tjänar till att lösa denna fråga utan kräver cell nummer och användningen av reagens som normalt inte leder till rutinmässig kvalitetskontroll av hPSC kulturer. Därmed har utvecklingen av praktiska och reproducerbar sätt att skapa prover monolager cell med bevarad integritet för markör utvärdering många fördelar inom stamcellsforskningen. Detta gynnar i hög grad immuncytokemiska analysen eftersom enskilda celler från cellslager lätt kan observeras och kvantifieras för uttrycket av specifika markörer. Mot detta mål, var en self-made cytospin apparat konstruerad och optimerad för användning med immuncytokemiska färgning. Två cellytan markörer (SSEA3/SSEA4) uttryck analyserades i en variant BG01 stamceller linje för tillämpningen av detta protokoll.

Protocol

Del 1: Suspension immuncytokemiska färgning Celler skördas i en enda cell suspension. Cellerna överförs sedan till 1,5-2ml mikrocentrifugrör och centrifugeras vid 200g i 4 minuter. Cellerna tvättas genom att aspirera ut supernatanten resuspenderas i 1 mL PBS – (utan Mg 2 + och Ca 2 +) och därefter centrifugeras igen vid 200g i 4 minuter. Detta bör göras två gånger. Efter tvätt, celler sedan fastställas av re-avbryta dem i 1 mL 4% paraformaldehyd…

Discussion

Vid tillämpning av vårt laboratorium, är en 35mm maträtt av kulturer stamceller som odlas på möss embryonala fibroblaster (MEFs) tilldelas för immuncytokemiska färgningsproceduren för användning med cytospin apparaten. Cellerna är sedan samlas in genom enzymatisk passaging, ta bort så mycket av MEF lager som möjligt i en enda cellsuspension. Om effektivare stamceller isoleras från MEF lagret önskas kan bisamhällena manuellt plockas sedan rötas till suspension. Om mataren fria villkor används i växande…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Lab Tek Permanox Chamber Slide		Thermo Fisher Scientific	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned		Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips		USA Scientific	1121-3810
Microscope Cover Glass		Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280		Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS		Gibco	14190
Normal Goat Serum		Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride		CalBioChem	268298