Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante
Summary
Quantificação de DNA dupla fita-estrias usando formação γH2AX como um marcador molecular tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para a quantificação dos focos γH2AX após a exposição das células à radiação.
Abstract
DNA dupla fita-breaks (LAP), que são induzidos por qualquer processos metabólicos endógenos ou por fontes exógenas, são uma das lesões DNA mais críticos com relação à sobrevivência e preservação da integridade genômica. Uma resposta rápida à indução de LAP é fosforilação da variante histona H2A, H2AX, na serina-139 resíduos, na altamente conservada motivo SQEY C-terminal, formando γH2AX<sup> 1</sup>. Após a indução de LAP, H2AX é rapidamente fosforilada pela fosfatidil-inosito 3-quinase (Pikk) família de proteínas, ataxia telangiectasia mutantes (ATM), subunidade proteína-quinase DNA catalítico e ATM e Rad3 relacionados (ATR)<sup> 2</sup>. Tipicamente, apenas alguns pares-base (pb) estão implicados em uma DSB, no entanto, não há amplificação de sinal significativo, dada a importância das modificações da cromatina na sinalização de danos ao DNA e reparo. Fosforilação de H2AX mediada predominantemente por ATM espalha para áreas adjacentes da cromatina, afetando aproximadamente 0,03% do total celulares H2AX por DSB<sup> 2,3</sup>. Isso corresponde a fosforilação de aproximadamente 2000 moléculas H2AX abrangendo ~ 2 Mbp regiões da cromatina em torno do local do DSB e resulta na formação de discretos focos γH2AX que podem ser facilmente visualizados e quantificados por microscopia de imunofluorescência<sup> 2</sup>. A perda de γH2AX no DSB reflete reparação, no entanto, há alguma controvérsia quanto ao que define o reparo completo da LAP, tem sido proposto que a recombinação de dois filamentos de DNA é adequada no entanto, também tem sido sugerido que restabelecimento do estado de compactação da cromatina originais é necessário<sup> 08/04</sup>. O desaparecimento de γH2AX envolve pelo menos em parte, pela desfosforilação fosfatases, fosfatase e fosfatase 2A 4C<sup> 5,6</sup>. Além disso, a remoção de γH2AX pela redistribuição envolvendo troca de histonas com H2A.Z tem sido implicado<sup> 7,8</sup>. Importante, a análise quantitativa de γH2AX focos levou a uma ampla gama de aplicações na pesquisa médica e nuclear. Aqui, nós demonstrar o método mais comumente usado de imunofluorescência para avaliação de danos no DNA inicial de detecção e quantificação de γH2AX focos em γ-irradiados aderente queratinócitos humanos<sup> 9</sup>.
Protocol
Discussion
Após a exposição à radiação ionizante (raios-γ), forma γH2AX focos rapidamente e os números de focos atingir um máximo entre 30-60 minutos 2. Portanto, nosso ponto de uma hora o tempo pós-irradiação reflete DSB formação inicial. Temos usado a dose de radiação clinicamente relevantes de 2 Gy para nosso experimento. No entanto, o método pode ser usado para as doses de radiação até 4 Gy para a detecção da formação inicial DSB; sobreposição significativa de focos impede a quantificaçã…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O apoio do Instituto Australiano de Ciência Nuclear e Engenharia é reconhecido. TCK foi o ganhador de prêmios AINSE. Lab Medicine epigenômico é suportado pelo National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM é apoiada por Melbourne Research (University of Melbourne) e Biomedical Imaging bolsas complementares CRC. O apoio de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody e ISKA Carmichael) foi inestimável para este trabalho.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nunc Denmark | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Falcon | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
Riferimenti
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , (2009).
