Beschrijven we een klein molecuul-gebaseerd protocol voor de differentiatie van muis embryonale stamcellen in de oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's). Dit protocol genereert Olig2 + NG2 + OPC's met een hoge efficiëntie met 30 dagen van differentiatie. We beschrijven ook een methode om "spike" OPC's die kunnen vuren actiepotentialen genereren.
Oligodendrocyten zijn de myelinating cellen van het centrale zenuwstelsel. Voor regeneratieve celtherapie bij demyeliniserende ziekten, is er groot belang bij de afleiding van een zuivere populatie van de lijn-vastgelegde oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's) voor transplantatie. OPC's worden gekenmerkt door de activiteit van de transcriptiefactor Olig2 en de oppervlakte-expressie van een proteoglycan NG2. Met behulp van de GFP-Olig2 (G-Olig2) muis embryonale stamcellen (Mesc) reporter lijn hebben we optimale condities voor de differentiatie van mESCs in GFP + + Olig2 NG2 + OPCs. In ons protocol, beschrijven we eerst de generatie van embryoid instanties (EBS) uit mESCs. Ten tweede, beschrijven we de behandeling van Mesc-afgeleide EBS met kleine moleculen: (1) retinoïnezuur (RA) en (2) een sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) onder bepaalde voorwaarden aan cultuur EB differentiatie direct in de oligodendroglia geslacht. Door deze aanpak kunnen OPC's worden verkregen met een hoge efficiëntie (> 80%) in een periode van 30 dagen. Cellen, afkomstig van mESCs in dit protocol zijn fenotypisch gelijk aan OPC's ontleend aan het primaire weefselkweek. De Mesc afgeleide OPC's tonen niet de stekelige woning beschreven voor een subpopulatie van de hersenen OPCs in situ. Om dit te onderzoeken elektrofysiologische woning, beschrijven we de generatie van spiking Mesc-afgeleide OPCs door ectopisch uiten Na<sub> V</sub> 1,2 subunit. De pieken en nonspiking cellen verkregen van dit protocol zal helpen vooruit functionele studies op de twee subpopulaties van OPCs.
Embryonale stamcellen (SER), geïsoleerd uit een blastocyst embryo, kunnen differentiëren in alle cellijnen van het organisme 3, 4, die een in vitro model systeem voor het bestuderen van vroege zoogdieren ontwikkeling, met inbegrip oligodendrocyt specificatie. mESCs is aangetoond dat ze in de oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's) onderscheiden met de behandeling van sonic hedgehog (Shh) 5. Bovendien is de Shh-geïnduceerde OPC differentiatie van mESCs behoudt zich het juiste timing waargenomen in de embryonale ontwikkeling 6. Daarom is de aard van de in vitro OPC differentiatie van mESCs beschouwd worden in overeenstemming met wat er is geleerd van in vivo ontwikkeling. Hier, met behulp van de kleine moleculen RA en de Shh agonist Pur, hebben we met succes gedifferentieerde de G-Olig2 mESCs in GFP + + Olig2 NG2 + OPC's met een hoge efficiëntie.
OPCs, gekenmerkt door de uitdrukking van de proteoglycanen NG2 7 en de helix-loop-helix transcriptiefactor Olig2 8, het genereren van oligodendrocyten in de zich ontwikkelende en volwassen CNS, waar ze bestaan uit een aanzienlijk percentage (~ 5%) van de totale cellen en zijn de prolifererende belangrijkste celtype 9. Al bijna twee decennia onderzoekers hebben aangetoond Na V-kanalen worden uitgedrukt in een subpopulatie van OPC's en kan worden geactiveerd bij de depolarisatie 10, 11. Bovendien, een recente opvallende vaststelling was dat in negen in situ rat CNS witte stof, OPC's (~ 50%) actiepotentialen gegenereerd wanneer gedepolariseerd, afhankelijk van de expressie van de voltage-gated natrium (Na V) kanalen, en dus kan worden onderverdeeld in pieken en nonspiking subpopulaties. Echter, de functies van deze spiking eigenschappen zijn nog grotendeels onbekend. Wij vonden dat, elektrofysiologische, de Mesc-afgeleide OPC's onderscheiden met de Shh-afhankelijke protocol, niet hetzelfde als de in situ hersenen OPCs. Na de introductie van subunit Na 1,2 V, deze stille Mesc afgeleide OPC's in staat waren spiking.
Zo kan de stekelige / nonspiking Mesc-afgeleide OPC's en differentiatie protocol hier beschreven te vergemakkelijken (1) studie van de functionele verschillen tussen de pieken en nonspiking OPCs, (2) toetsing van nieuwe factoren die de natriumkanalen uitdrukking zou kunnen bevorderen in de Mesc afgeleide OPCs, ( 3) het ontwikkelen en optimaliseren van de differentiatie protocol van de OPC's van menselijke ESC of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs).
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd deels gesteund door subsidies aan WD van National Institutes of Health (RO1 NS059043 en RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Stichting voor Anemie Research, Feldstein Medical Foundation, en de Shriners Hospitals for Children.
We willen graag Dr David Pleasure en Jennifer Plane bedanken voor suggesties. Wij verklaren geen concurrerende belangen met betrekking tot dit artikel.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | ||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | ||
Retinoic acid | Sigma | R-2625 | ||
Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | ||
FGF-2 | Millipore | GF003 | ||
BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |