Погрузка на грузовые кинезин Powered молекулярной Автобусы
Summary
Молекулярные челноки, состоящий из микротрубочек функционализированных скользит по поверхности, придерживался кинезин моторных белков могут служить в качестве наноразмерных транспортной системы. Здесь, сборка типичной системе трансфер описывается.
Abstract
Клетки развивались сложные молекулярные машины, такие как кинезин моторных белков микротрубочек и нитей, для поддержки активного внутриклеточного транспорта грузов. Хотя кинезины хвост домен связывается с различными грузами, домены кинезины голову использовать химическую энергию, запасенную в молекулах АТФ, чтобы шаг по микротрубочек решетки. Длинные, жесткие микротрубочки служат треков для дальних внутриклеточного транспорта.
Эти двигатели и нити могут быть также использованы в microfabricated синтетических средах в качестве компонентов молекулярных челноков 1. В часто используемых дизайн, кинезин двигатели крепятся к поверхности трассы через их хвосты, и функциональных микротрубочки служат в качестве груза несущих элементов, которые в движение с помощью этих двигателей. Эти челноки могут быть загружены с грузом, используя сильное и избирательное связывание между биотином и стрептавидином. Ключевых компонентов (биотинилированного тубулина, стрептавидина и биотинилированного груза) имеются в продаже.
Опираясь на классическое перевернутой анализа подвижности 2, строительство молекулярные челноки подробно здесь. Кинезин моторных белков адсорбируются на поверхности предварительно нанесенным покрытием с казеина; микротрубочки полимеризуются с биотинилированного тубулина, придерживались кинезин, а затем покрыты родамин-меченого стрептавидином. Концентрации АТФ поддерживается на subsaturating концентрации, чтобы достичь скорости скольжения микротрубочек оптимальным для погрузки груза 3. Наконец, биотинилированного флуоресцеина меченых наносферы добавляются в качестве груза. Наносфер, придают микротрубочек в результате столкновений между микротрубочек скольжение и наносфер присоединения к поверхности.
Протокол может быть легко изменены, чтобы загружать как различные грузы, такие как ДНК биотинилированного 4, квантовые точки, 5 или разнообразных антигенов с помощью антител биотинилированного 4-6.
Protocol
Discussion
С незначительными изменениями этот протокол был успешно используется различными группами, чтобы собрать кинезин-микротрубочек основан анализов подвижности. 10 мМ DTT в окончательном решении моторики может быть заменен на 0,5% β-меркаптоэтанола. Стандартные решения (BRB80AF, KIN20 и MT1000) больше,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы с крупной задолженностью, чтобы Джонатан Говард, чья группа разработала основной протокол для анализа скольжения моторики который впоследствии был адаптирован нами. Финансовая поддержка со стороны NSF гранта DMR0645023 это с благодарностью.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
| Biotin tubulin | Cytoskeleton Inc. | T333 | ||
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
Riferimenti
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).
- Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles. Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).
- Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins. Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).
- Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins. Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).
- Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes. J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).
- Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes. Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).
- Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).
- Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).
