我们描述了一种用于微阵列分析的方法来确定所有的tRNA相对酰化水平<em> S。 cerivisiae。</em
tRNA的氨酰化,或充电,水平可以迅速改变细胞内的环境[1]。 tRNA的变化,在原核和真核细胞收费水平,导致翻译调控,这是一个重大的应激反应的细胞机制。熟悉的例子是在严格的响应<em> E。大肠杆菌</em>和酵母中的GCN2压力反应途径([2-6])。最近的工作IN<em> E。大肠杆菌</em><em> S。酵母</em>表明,tRNA的收费模式是高度动态的,取决于细胞[1,6,7]的压力。高度动态的变量的性质,tRNA的收费使得有必要在基因组的规模确定tRNA的收费水平的变化,以充分阐明细胞反应环境变化。在这次审查中,我们目前的方法同时测量所有的tRNA相对充电水平<em> S。酵母</em>。酵母虽然这里介绍的协议,这个协议已经成功地应用在各种各样的生物体,包括确定相对的收费水平<em> E。大肠杆菌</em>和人类细胞培养[7,8]。
我们提出了一个方法,同时确定在基因组范围内的所有tRNA的收费水平相对。这里介绍的协议进行了优化, 为 S. 酵母 ,它也被成功地用来衡量在大肠杆菌 tRNA的充电配置文件大肠杆菌和人类细胞培养。它可以修改,以适应任何生物体与已知的基因组序列(允许所有的tRNA基因的注释),只要可以得到总收取的tRNA。
The authors have nothing to disclose.
酵母泛实验室工作是由一个从日本味之素公司,日本和美国国立卫生培训资助T32GM007183 – 33研究院授予。我们感谢酵母项目的长期合作在美国印第安纳大学医学院的罗纳德WEK博士。我们也感谢金佰利Dittmar博士充电芯片的方法开发的tRNA。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | ||
E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | ||
E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | ||
E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | ||
E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | ||
T4 DNA ligase | USB | 70042X | ||
PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | ||
Hyb4 station | Digilab | |||
GenePix 4000B scanner | Axon instruments | |||
GenePix 6.0 | Axon instruments |