Summary
该方案描述了抗菌光动力疗法（aPDT）在口腔念珠菌病小鼠模型中的应用。使用姜黄素和蓝色LED灯的水溶性混合物进行aPDT。
Abstract
抗菌光动力疗法 （aPDT） 已 在体外进行了广泛的研究，感染的临床前动物模型适用于在临床试验之前评估替代疗法。本研究描述了 aPDT 在口腔念珠菌病小鼠模型中的疗效。40只小鼠通过皮下注射泼尼松龙进行免疫抑制，并使用先前浸泡在 白色念珠菌 细胞悬浮液中的口腔拭子接种它们的舌头。在实验过程中 ，四 环素通过饮用水给药。真菌接种5天后，将小鼠随机分为8组;第九组未经治疗的未感染小鼠作为阴性对照（n = 5）。用蓝色LED灯（89.2 mW /cm 2;~455 nm）和无光（分别为C + + 和 C + L- 组）测试姜黄素混合物的三种浓度（20 μM、40 μM 和 80 μM）。仅光照 （C-L+）、不治疗 （C-L-） 和无感染动物被评估为对照。使用 Welch 方差分析和 Games-Howell 检验 （α = 0.05） 分析数据。口腔念珠菌病在所有受感染的动物中都已确定，并通过舌背上的特征性白斑或假膜在宏观上可视化。组织病理学切片证实，在C-L-组中，酵母和细丝的存在仅限于上皮的角化层，并且在从使用40μM或80μM姜黄素进行aPDT的小鼠获得的图像中，真菌细胞的存在在视觉上减少。与C-L-组相比，由80μM姜黄素介导的aPDT促进了2.47 log10 的菌落计数减少（p = 0.008）。所有其他组的菌落数量均无统计学意义减少，包括光敏剂（C+L-）或光敏（C-L+）组。姜黄素介导的aPDT减少了小鼠舌头的真菌负荷。
Introduction
口腔念珠菌病（OC）是口腔的主要真菌感染;它是由 念珠菌 属的过度生长引起的。OC 的诱发因素包括内分泌功能障碍、使用广谱抗生素、放疗和化疗、营养缺乏、口干症（唾液流量低）、使用假牙、卫生条件差，尤其是免疫抑制1。在 念珠菌 物种中， 白色念珠菌 是最普遍和最致命的一种;它被发现为人体内的共生物种和机会性病原体。 白色念珠菌 有能力将其形态从共生酵母（胚孔）转变为致病丝（菌丝和假菌丝）2。丝状形式，尤其是菌丝，可以通过内吞作用或主动渗透侵入宿主上皮，引起感染3. 白色念珠 菌的其他毒力因子包括粘附、生物膜形成以及脂解和水解酶和毒素的分泌，例如脂肪酶、磷脂酶、蛋白酶和念珠菌溶血素4。
OC治疗包括使用抗真菌药物，特别是局部多烯和唑类（制霉菌素和咪康唑）5。然而，它们仅显示出短期疗效，并且复发频繁。此外，抗真菌药物的过度使用引发了抗真菌药物耐药性发展和传播的问题6。因此，需要替代疗法，例如抗菌光动力疗法 （aPDT），它在氧气存在下将光敏剂 （PS） 和适当波长（与 PS 吸收相同）的光结合在一起。PS与细胞结合或被细胞吸收，当被光激活时，会产生对致敏细胞有毒的活性氧（ROS）7。
在aPDT中，使用的光敏剂（PS）之一是姜黄素（CUR），这是一种从姜黄植物（Curcuma longa L.）的根茎中提取的天然化合物。姜黄素具有多种治疗特性，包括抗炎、抗氧化、抗癌和抗菌能力 8,9。先前的一项研究发现，利用 CUR 的 aPDT 有效地减少了口腔念珠菌病小鼠模型中的白色念珠菌，而不会对宿主的组织造成任何伤害10。CUR是从姜黄中提取的主要姜黄素，但其他多酚，如脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素，也存在于这种植物中。姜黄素介导的 aPDT 对导管中生长的金黄色葡萄球菌的生物膜具有抗菌活性11。然而，据我们所知，其对白色念珠菌的抗真菌活性仍不清楚。因此，在这项研究中，我们评估了在 OC 小鼠模型中由姜黄素盐介导的针对白色念珠菌的 aPDT。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
使用小鼠的研究方案已获得UNESP阿拉拉夸拉牙科学院的动物使用伦理委员会（案例编号05/2008和09/2020）的批准。 白色念珠菌 （ATCC 90028）作为参比菌株。本研究使用体重范围为 20-30 g 的六周龄雌性瑞士小鼠 （n = 45）。这些动物由圣保罗州立大学、UNESP、Botucatu提供。
1. PS的制备和aPDT光源的选择
- 根据要测试的物质的规格准备PS。
注：在这项研究中，使用姜黄素类水溶性混合物（基于CUR的水溶性盐混合物12）作为PS（参见 材料表 和 图1）。20μM、40μM和80μM（分别为15.6、29.2和58.4mg/L）的稀释液在使用前立即在超纯水中制备，并保持在5°C。 - 选择具有适当波长（与PS吸收波长相同）的光设备，该光设备能够均匀地同时照亮整个光敏目标，而不会加热组织。
注：在这项研究中，使用了由圣保罗大学，圣卡洛斯，SP，巴西圣保罗大学）设计的包含发光二极管（LED， 见材料表）的手机。在大约 455 nm 的蓝色波长下，光提供的输出功率为 89.2 mW/cm2 。
2. 白色念珠菌 接种物的制备
- 将参比菌株白色 念 珠菌（ATCC 90028）保存在-80°C下含有50%甘油的酵母 - 蛋白胨 - 葡萄糖（YEPD，参见 材料表）中直至使用。
- 在室温下解冻冷冻菌株，将100μL等分试样铺在培养皿上，用Sabouraud葡萄糖琼脂（SDA）和氯霉素（参见 材料表），并在37°C孵育48小时。
- 将五个菌落转移到含有2%葡萄糖（YNBg）培养基的10mL酵母氮肉汤中，并在37°C有氧生长16小时。
- 在新鲜YNBg（1：10）中稀释酵母培养物，并在37°C有氧孵育，直到光密度达到生长的中对数阶段。
注意：之前对每个实验室的微生物生长曲线进行标准化。在目前的研究中，允许培养物孵育约8小时，直到它们达到生长的中对数阶段，如540nm处的光密度（OD540）所示，平均值为0.536±0.062任意单位（平均值±标准差[SD]）。 - 在室温下以5,000×g离心培养物5分钟，弃去上清液，并用相同体积的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS;0.136M NaCl，2mM KCl，1mM KH2PO 4,10mM Na2HPO4，pH 7.4）洗涤沉淀两次。
- 使用100μL等分试样在PBS中进行四次连续10倍稀释，在SDA板上摊开稀释液，并在37°C孵育48小时进行菌落计数。作为标准，真菌悬浮液的浓度约为每毫升 4.5 ×10 7 个 菌落形成单位 （CFU/mL）]。
3. 诱导小鼠OC
注：以下方法先前由Takakura等人13描述，并由我们的小组10,14复制，并进行了一些修改。
- 将小鼠随机分布在九组（n = 5）中，对应于相同数量的治疗（补充文件1）。
注意：小鼠的口腔对 念珠菌 生长应该是阴性的。这需要通过擦拭口腔并将样品镀在 SDA 上来检查。 - 将动物保存在丙烯箱10（每箱最多5只小鼠）中，用刨花作为地板覆盖物，在23±2°C的温控动物饲养箱中，在12/12小时的光/暗循环下。无需提供具体的富集。
- 随意维持小鼠挤出小鼠饮食和过滤水。
- 皮下注射免疫抑制药物泼尼松龙（100mg / kg体重，见 材料表），在第一天首次向C+L + 20，C + L + 40，C + L + 80，C + L- 20μM，C + L- 40，C + L- 80，C-L +和C-L-（补充文件1）的所有成员注射。
注意：将来自同一组的小鼠放在同一个盒子中，并每天监测它们是否有任何压力和体重减轻的迹象。如果发现压力或体重减轻，请寻求兽医建议，以镇痛或改变食物/水。 - 从第一天开始直到实验结束，在饮用水中以 0.83 mg/mL13 提供盐酸四环素。
- 在第二天接种小鼠舌头，包括 C+L+ 20、C+L+ 40、C+L+ 80、C+L-20、C+L-40、C+L-80、C-L+和 C-L-（补充文件 1），用 白色念珠菌 接种物。不要接种阴性对照组（NCtrl）的小鼠。
- 在进行接种之前，通过在每块大腿肌肉上肌肉注射10mg / kg氯丙嗪氯化物（见 材料表）来镇静动物。
- 通过将无菌拭子（每只动物一个）浸泡到新鲜制备的（即接种前立即制备的） 白色念珠菌标准化悬浮液中，对小鼠进行口内接种。
- 将镇静的小鼠置于仰卧位。用无菌镊子轻轻地将他们的舌头从嘴里拉出来。用浸湿的棉签擦拭每只老鼠的舌头 30 秒。监测小鼠，直到它们从镇静中恢复过来。
- 在第 5 天，补充皮下注射泼尼松龙（100 mg/kg 体重）以维持免疫抑制。
注意：该方案足以在口内接种后将感染保持 7 天。协议时间线如 图 2 所示。
4. 抗菌光动力疗法和白色 念珠菌 从口腔病变中恢复
- 在第七天，在治疗之前，使用腹膜内注射盐酸氯胺酮（100mg / kg体重）与甲苯噻嗪（10mg / kg体重）联合麻醉动物（见 材料表）。
- 将每只动物仰卧放置在垫装置14,15上，该装置配有不锈钢丝，可以缠绕在门牙上以保持嘴巴张开。
注意：建议使用等温垫在镇静时加热小鼠，防止室温下体温过低并避免与麻醉相关的死亡率15。当捏住脚趾以确认麻醉深度时，应通过缺乏戒断反射来监测每个麻醉动物。如果需要，可以给予原始剂量的 1/3 氯胺酮维持剂量（不含甲苯噻嗪）。 - 下颌骨和脸颊缩回，轻轻地将舌头放在嘴外。
- 对于来自C + L +组的小鼠，在舌背上移液70μLPS（以测试浓度之一）。将小鼠保持在黑暗环境中20分钟作为照射前期。确保在此期间，每只动物的舌头保持在口腔内，以防止光敏剂（PS）被摄入。
- 光敏期过后，将舌头从嘴里拉出来进行照明。将 LED 设备放在舌背上并以 37.5 J/cm2 （使用现有设备 7 分钟）照射（图 3）。
- 对于来自C + L-组的动物，在舌背上移取70μL的PS之一，并使这些小鼠在黑暗中保持27分钟。
- 对于来自C-L +组的动物（用光处理，没有任何先前的光敏作用），在舌背上移液70μL无菌盐水溶液。将小鼠置于黑暗中20分钟，然后以37.5J / cm2 （使用本装置7分钟）照射其舌头。
- 对于来自C-L-组的小鼠（既未用PS处理也不用光处理），将70μL无菌盐水溶液移液移液在舌背上，并将它们置于黑暗中27分钟。
- 治疗后立即从所有小鼠的舌头中恢复 白色念珠菌 。用无菌棉签擦拭舌背 1 分钟。
- 将每个样品拭子放入含有 1 mL 无菌盐水的试管中并涡旋 1 分钟以重悬微生物细胞。
- 立即在 PBS 中连续稀释 10 倍，并在 SDA 板上将 25 μL 等分试样平板一式两份。将板在37°C有氧孵育48小时。
- 48小时后，使用数字菌落计数器（参见 材料表）确定酵母菌落计数。计算每只动物的 白色念珠菌 负荷（CFU/mL）。
- 将 CFU/mL 值转换为对数10 ，并根据实验设计和数据假设进行正确分析。
注：在本研究中，使用了 Welch 单因素方差分析和 Games-Howell 事后检验 （α = 0.05）16 。
5. 组织病理学分析
- 在第八天，通过腹腔内注射用100mg / kg的氯胺酮与10mg / kg的甲苯噻嗪联合麻醉小鼠，并用过量的氯胺酮（200mg / kg通过腹腔内给药）对小鼠实施安乐死。通过检查无呼吸运动（呼吸暂停）和无心跳（心脏停搏）来确认死亡。
- 小心地捏住舌头并将其从动物的嘴里拉出来。使用手动手术刀，在环状前切开一个切口，手术切除整个舌头，而不会对前部和中央区域造成任何伤害。
- 将舌头固定在10%缓冲福尔马林（pH 7.2-7.4）中24小时，并在流水中洗涤2小时。
- 继续加入石蜡过程：脱水，澄清和浸渍10,14。
- 使用切片机切割连续切片（5μm厚），然后将切片贴在载玻片上。继续使用高碘酸-希夫和苏木精（PAS-H）对这些切片进行染色，以进行组织病理学检查，并通过在光学显微镜下观察来鉴定真菌。
- 请病理学家（最好对所研究的群体不知情）检查由于 白色念珠菌 感染引起的组织反应。
- 描述组织（上皮和结缔组织）的组织学特征，特别是不同强度的局部炎症反应。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OC的小鼠模型显示所有感染小鼠的舌头上有典型的白斑和假膜（图4A）。从C-L-动物中回收 的白色念珠菌 证实了该微生物的组织定植（值范围为1.62 x 104 至4.80 x 105 CFU/mL）。正如预期的那样，来自NCtr组的动物在取样后没有表现出任何组织改变或菌落生长（图4B）。
当在80μM下使用姜黄素进行光敏化时，aPDT降低了 白色念珠菌 的活力（图5）。与C-L-组相比，80μM PS介导的aPDT实现的平均log10 减少为2.47（p = 0.008）。
从小鼠舌头中回收的 白色念珠菌 菌落数在用姜黄素处理的小鼠中没有显着差异没有显着差异没有光照（C+L-组），用光处理但先前没有光敏的小鼠（C-L+组）和未处理的小鼠（C-L-组）（p ≥ 0.210）。
未感染动物舌头的组织学特征（NCtr）显示正常/健康组织，包括完整的固有层，基底膜和丝状（图6A）。相反，当检查C-L-组小鼠舌头的组织病理学图像时，很明显酵母和细丝存在于上皮的角质化层内，尽管没有真菌浸润。在下面的结缔组织中，观察到轻微的炎症反应，主要由单核细胞介导，丝状明显缺失（图6B）。C+L-和C-L+组小鼠舌头的组织学分析显示出相似的特征。相比之下，用80μM姜黄素介导的aPDT治疗的小鼠的舌头切片显示真菌细胞数量减少，主要局限于上皮的角质化层（图6C）。
图1：光敏剂的化学结构。 用作光敏剂的水溶性盐混合物的化学结构，包括53.4%的天然姜黄素和46.6%的其他姜黄素类化合物（去甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素）。最终平均分子量为 730.32 g/mol。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：口腔念珠菌病和 aPDT 小鼠模型的方案时间表。 概述口腔念珠菌病和抗菌光动力疗法 （aPDT） 小鼠模型方案的时间表。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：光敏后小鼠舌头的照明。光敏化后（用光敏剂孵育感染组织），使用蓝色（~455nm）LED灯以37.5 J /cm 2照射舌头。请点击这里查看此图的较大版本.
图4：小鼠口腔念珠菌病模型中的白色病变。 （A）描述在口腔念珠菌病小鼠模型中观察到的白色病变的代表性图像。（B） 阴性（未感染）对照。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：从小鼠舌头中回收的 白色念珠菌 。 数据表示治疗组的平均值±log 10（CFU/mL）的标准差。Welch单因素方差分析表明，各组间治疗效果有统计学意义（p < 0.001）。根据 Games-Howell 检验 （p≤ 0.030），均值旁边的不同小写字母 （a、b、c） 表示具有统计学意义的差异。 请点击这里查看此图的较大版本.
图6：小鼠舌头组织学切片的代表性图像。 用PAS-H染色小鼠舌头的组织学切片，并以200倍的速度捕获图像。 （A）无诱导口腔念珠菌病，光敏和照明的阴性对照小鼠（NCtr组）。（B）具有诱导的口腔念珠菌病的小鼠，既不光敏也不暴露于LED照明（C-L-组）。（C）诱导口腔念珠菌病的动物，暴露于80μM姜黄素类化合物和37.5J / cm2 LED照明（C + L + 80组）。比例尺 = 100 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
补充文件1：实验组。 本研究中使用的实验组列表。 请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
白色念珠菌与免疫功能低下、糖尿病、长期使用抗生素和口腔卫生不良的个体的口腔和食管感染有关 1,3。人类传染病的研究需要进行体外和体内研究，然后才能安全准确地设计临床试验。本研究描述了一种建立OC小鼠模型的方法，可用于评估白色念珠菌口腔感染的发病机制和抗真菌方法的疗效15,16,17,18,19。
这里使用的OC小鼠模型被成功建立，从病变中恢复的大量真菌负荷以及在感染小鼠舌头的宏观和组织病理学分析中观察到的特征性感染特征证明了这一点。许多研究都使用了类似的OC小鼠模型。在这种模型中，雌性小鼠被免疫抑制并接种白色念珠菌，导致舌头10,13,14,15,20,21的病变。泼尼松龙（一种糖皮质激素）的免疫抑制抑制中性粒细胞对白色念珠菌的活性 22.在这项研究中，雌性小鼠在感染白色念珠菌 13 之前一天和感染后三天皮下注射两次泼尼松龙进行免疫抑制。此外，在实验过程中在饮用水中施用四环素会干扰口腔细菌并帮助白色念珠菌茁壮成长，从而引起口腔菌群失调23,24。此外，肌肉注射氯丙嗪引起的镇静作用使动物在接种后无法立即饮水和进食。因此，真菌细胞与舌背接触的时间更长，使胚管的发育和从酵母到细丝（菌丝和假菌丝）的过渡成为可能，这是可以侵入人类上皮的白色念珠菌的致病形态。Teichert 等人 25 使用免疫缺陷方案在小鼠中诱导 OC，仅回收 2 x 102 CFU/mL 的白色念珠菌。
虽然 Totti 等人 26 利用了 sialoadenechim 切除的小鼠，并用白色念珠菌悬浮液进行了四次单独的接种，但值得注意的是，在他们的案例中，大多数动物在实验过程中都没有持续感染。相比之下，在本研究中，真菌细胞接种仅进行一次，结果从口腔中回收了 104 CFU/mL 的白色念珠菌。本研究采用了 Takakura 等人 13 描述的念珠菌病小鼠模型，他们使用从皮肤念珠菌病患者 （106 CFU/mL） 中分离的临床菌株进行口服接种。接种后 3 至 7 天，从小鼠口腔中回收 10 5-106 CFU/mL 白色念珠菌 13。Takakura 等人的方法13 与本研究的区别包括接种物中使用不同浓度的真菌（本研究使用 107 CFU/mL 的白色念珠菌）和不同的白色念珠菌菌株进行口服接种（此处使用参考菌株 ATCC 90028）。Carmello等人[20]采用了类似的方案，涉及使用免疫抑制动物。然而，他们在实验的第 1、5、9 和 13 天向动物额外皮下注射了两次泼尼松龙。他们的研究显示，在感染后 5 至 16 天的一段时间内，分配给受感染动物口腔病变的评分与 CFU/mL 的数量之间存在正相关关系。在以前的研究中已经明确指出，密切监测麻醉下的动物以防止体温过低至关重要。仅在必要时，应谨慎给予氯胺酮的额外维持剂量27.
关于aPDT应用的功效，结果表明，先前用80μM姜黄素盐混合物处理的舌头的辐照导致白色念珠菌的活力显着降低（2.47对数10）。组织学分析显示，用 80 μM 姜黄素介导的 aPDT 处理的舌头切片显示真菌细胞数量减少，仅限于角质化层，并且炎症反应低。值得强调的是，在所有感染白色念珠菌的小鼠中都检测到炎症反应。这一观察结果意味着，在所有aPDT组中观察到的炎症可能与念珠菌感染有关，而不是归因于aPDT，这一发现与我们之前的研究一致10,13,14,15。
先前的研究使用 CUR、亚甲蓝和光二嗪 （PDZ） 作为 PS，并获得了有希望的结果10、20、24、25、27。在一项类似的研究10 中，联合暴露于 CUR 和 LED 光导致 白色念珠菌的生存能力显着降低;然而，使用80μM CUR和光将真菌活力降低了4.0 log10。Dovigo 等人 10 仅使用 CUR 作为 PS，而我们使用的盐含有来自 C. longa 的三种主要姜黄素类化合物。当连续五天使用CUR和LED灯治疗小鼠口腔念珠菌病时，作者观察到真菌活力降低了1.11 log10 21。当使用亚甲蓝作为 450 μg/mL 和 500 μg/mL 的 PS 时，aPDT 完全根除小鼠口腔中的 白色念珠菌 25。此外，当 PDZ 介导 aPDT （100 mg/L） 时，观察到 3.0 log10 减少和口腔病变完全缓解20。此外，与未治疗组相比，aPDT 增加了 TNF-α 的表达20。在一项使用氟康唑耐药菌株的研究中，PDZ 介导的 aPDT （200 mg/L） 促进了相当于 1.3 log1027 的减少。此外，aPDT与制霉菌素的组合导致真菌活力显着降低，相当于减少2.6 log10，同时显着改善口腔病变和炎症反应减少27。总的来说，这些研究为aPDT在减少口腔念珠菌病小鼠模型中的真菌负荷方面的有效性提供了令人信服的证据，强调了其作为临床治疗选择的潜力，因为它具有抗菌功效，而不会对宿主组织造成伤害。
总之，本研究中使用的 OC 小鼠模型适用于模拟感染和评估 aPDT 疗效。作为限制，这里使用的OC模型仅使用了一种白色念珠菌的参考菌株（未评估其他菌株，临床分离株和非白色念珠菌物种）。此外，皮质类固醇诱导的免疫抑制用于小鼠发生口腔感染可能不模仿其他免疫缺陷状态，例如由于HIV感染引起的免疫缺陷状态。发生OC的宿主条件也可能存在差异，例如小鼠和人类的口腔微生物群。该协议应进一步扩展，以评估由多个物种或来自同一物种的不同菌株形成的混合生物膜。此外，保持小鼠充分镇静并防止体温过低，同时避免与麻醉相关的死亡是该方案中最困难的步骤。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
作者感谢FAPESP（圣保罗研究基金会，过程编号FAPESP #2013/07276-1（CePID CePOF）和2008/00601-6的财政支持。我们还要感谢 Ana Paula Silva 博士提供有关 CUR 基水溶性盐的信息。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
References
- Vila, T., Sultan, A. S., Montelongo-Jauregui, D., Jabra-Rizk, M. A. Oral candidiasis: a disease of opportunity. Journal of fungi (Basel, Switzerland). 6 (1), 15 (2020).
- Sudbery, P. E.
- Moyes, D. L., Richardson, J. P., Naglik, J. R. Candida albicans-epithelial interactions and pathogenicity mechanisms: scratching the surface. Virulence. 6 (4), 338-346 (2015).
- Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
- Quindós, G., et al. Therapeutic tools for oral candidiasis: Current and new antifungal drugs. Medicina oral, patologia oral y cirugia buccal. 24 (2), e172-e180 (2019).
- Nishimoto, A. T., Sharma, C., Rogers, P. D. Molecular and genetic basis of azole antifungal resistance in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (2), 257-270 (2020).
- Gholami, L., Shahabi, S., Jazaeri, M., Hadilou, M., Fekrazad, R. Clinical applications of antimicrobial photodynamic therapy in dentistry. Frontiers in Microbiology. 13, 1020995 (2013).
- Trigo-Gutierrez, J. K., Vega-Chacón, Y., Soares, A. B., Mima, E. G. O. Antimicrobial activity of curcumin in nanoformulations: a comprehensive review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7130 (2021).
- Santezi, C., Reina, B. D., Dovigo, L. N. Curcumin-mediated Photodynamic Therapy for the treatment of oral infections-A review. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 409-415 (2018).
- Dovigo, L. N., et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis. Medical Mycology. 51 (3), 243-251 (2013).
- Zangirolami, A. C., Carbinatto, F., Filho, J. D. V., Bagnato, V. S., Blanco, K. C. Impact of light-activated curcumin and curcuminoids films for catheters decontamination. Colloids and SurfacesB: Biointerfaces. 213, 112386 (2022).
- Santezi, C., Tanomaru, J. M., Bagnato, V. S., Júnior, O. B., Dovigo, L. N. Potential of curcumin-mediated photodynamic inactivation to reduce oral colonization. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 15, 46-52 (2016).
- Takakura, N., et al. A novel murine model of oral candidiasis with local symptoms characteristic of oral thrush. Microbiology and immunology. 47 (5), 321-326 (2003).
- Mima, E. G., et al. Susceptibility of Candida albicans to photodynamic therapy in a murine model of oral candidosis. OralSurgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. 109, 392-401 (2010).
- Solis, N. V., Filler, S. G.
- Marôco, J. Análise Estatística com o SPSS Statistics 25. , ReportNumber 7th ed, Lisboa, Portugal. (2018).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L. Jr, Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS Microbiology Letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Experimental oral candidiasis in animal models. Clinical Microbiology Reviews. 14, 398-429 (2001).
- Chamilos, G., Lionakis, M. S., Lewis, R. E., Kontoyiannis, D. P. Role of mini-host models in the study of medically important fungi. The Lancet Infectious Diseases. 7, 42-55 (2007).
- Carmello, J. C., et al. Treatment of oral candidiasis using Photodithazine- mediated photodynamic therapy in vivo. PLoS One. 11 (6), e0156947 (2016).
- Sakima, V. T., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by curcumin-loaded polymeric nanoparticles in a murine model of oral candidiasis. Molecules. 23 (8), 2075 (2018).
- Abe, S., et al. A glucocorticoid antagonist, mifepristone affects anti-Candida activity of murine neutrophils in the presence of prednisolone in vitro and experimental candidiasis of prednisolone-treated mice in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 13 (4), 311-316 (1996).
- Jones, J. H., Russell, C., Young, C., Owen, D. Tetracycline and the colonization and infection of the mouths of germ-free and conventionalized rats with Candida albicans. Journal Antimicrobial Chemotherapy. 2 (3), 247-253 (1976).
- Russell, C., Jones, J. H. Effects of oral inoculation of Candida albicans in tetracycline-treated rats. Journal of Medical Microbiology. 6 (3), 275-279 (1973).
- Teichert, M. C., Jones, J. W., Usacheva, M. N., Biel, M. A. Treatment of oral candidiasis with methylene blue- mediated photodynamic therapy in an immunodeficient murine model. OralSurgery, Medicine, Pathology, Radiology and Endodontology. 93, 155-160 (2002).
- Totti, M. G. A., Santos, E. B., Almeida, O. P., Koga-Ito, C. Y., Jorge, A. O. C. Oral candidosis by Candida albicans in normal and xerostomic mice. Brazilian Oral Research. 18, 202-207 (2004).
- Hidalgo, K. J. R., et al. Antimicrobial photodynamic therapy in combination with nystatin in the treatment of experimental oral candidiasis induced by Candida albicans resistant to fluconazole. Pharmaceuticals (Basel). 12 (3), E140 (2019).
