Summary
Bu protokol, oral kandidiyazisin bir fare modelinde antimikrobiyal Fotodinamik Terapinin (aPDT) uygulanmasını açıklar. aPDT, suda çözünür bir kurkuminoid ve mavi LED ışık karışımı kullanılarak gerçekleştirildi.
Abstract
Antimikrobiyal Fotodinamik Tedavi (aPDT) in vitro olarak kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır ve klinik öncesi hayvan modelleri, klinik çalışmalardan önce alternatif tedavileri değerlendirmek için uygundur. Bu çalışma, oral kandidiyazisin bir murin modelinde aPDT'nin etkinliğini açıklamaktadır. Kırk fare, deri altı prednizolon enjeksiyonları ile immünosuprese edildi ve dilleri, daha önce bir C. albicans hücre süspansiyonuna batırılmış bir oral sürüntü kullanılarak aşılandı. Tetrasiklin, deney sırasında içme suyu yoluyla uygulandı. Mantar aşılamasından beş gün sonra, fareler rastgele sekiz gruba dağıtıldı; Tedavi edilmemiş enfekte olmamış farelerin dokuzuncu bir grubu negatif kontrol olarak dahil edildi (n = 5). Kurkuminoid karışımının üç konsantrasyonu (20 μM, 40 μM ve 80 μM) mavi bir LED ışıkla (89.2 mW /cm2; ~ 455 nm) ve ışıksız (sırasıyla C + L + ve C + L- grupları) test edildi. Tek başına ışık (C-L+), tedavi yok (C-L-) ve enfeksiyonu olmayan hayvanlar kontrol olarak değerlendirildi. Verilerin analizinde Welch analizi ANOVA ve Games-Howell testleri kullanıldı (α=0.05). Tüm enfekte hayvanlarda oral kandidiyazis kuruldu ve dillerin dorsumunda karakteristik beyaz lekeler veya psödomembranların varlığı ile makroskopik olarak görselleştirildi. Histopatolojik kesitler, C-L- grubunda epitelin keratinize tabakası ile sınırlı büyük bir maya ve filament varlığını doğruladı ve 40 μM veya 80 μM kurkuminoidlerle aPDT'ye maruz kalan farelerden elde edilen görüntülerde mantar hücrelerinin varlığı görsel olarak azaldı. 80 μM kurkuminoidlerin aracılık ettiği aFT, C-L- grubundakilere kıyasla koloni sayısında 2.47 log10'luk bir azalmayı destekledi (p = 0.008). Diğer tüm gruplar, ışığa duyarlılaştırıcı (C + L-) veya tek başına ışık (C-L +) grupları dahil olmak üzere koloni sayısında istatistiksel olarak anlamlı bir azalma göstermedi. Kurkuminoid aracılı aPDT, farelerin dillerinden mantar yükünü azalttı.
Introduction
Oral kandidiyazis (OC), ağız boşluğunun ana mantar enfeksiyonudur; Candida spp.'nin aşırı büyümesinden kaynaklanır. OK için predispozan faktörler arasında endokrin disfonksiyon, geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı, radyoterapi ve kemoterapi, beslenme yetersizlikleri, kserostomi (düşük tükürük akımı), protez kullanımı, kötü hijyen ve özellikle immünosupresyonyer alır 1. Candida türleri arasında Candida albicans en yaygın ve öldürücü olanıdır; İnsan vücudunda ortak bir tür ve fırsatçı bir patojen olarak bulunur. C. albicans , morfolojisini kommensal mayalardan (blastopores) patojenik filamentlere (hif ve psödohif) değiştirme yeteneğine sahiptir2. Filamentli formlar, özellikle hifler, endositoz veya aktif penetrasyon yoluyla konakçı epitelini istila ederek enfeksiyona neden olabilir3. C. albicans'ın diğer virülans faktörleri arasında yapışma, biyofilm oluşumu ve lipazlar, fosfolipazlar, proteinazlar ve kandidalizin4 gibi lipolitik ve hidrolitik enzimlerin ve toksinlerin salgılanması yer alır.
OC tedavileri, antifungal ajanların, özellikle topikal polienlerin ve azollerin (nistatin ve mikonazol) kullanımını içerir5. Bununla birlikte, sadece kısa süreli etkinlik gösterirler ve nüks sıktır. Ek olarak, antifungallerin aşırı kullanımı, antifungal direnç gelişimi ve yayılması sorununa yol açmıştır6. Bu nedenle, oksijen varlığında bir ışığa duyarlılaştırıcı (PS) ve ışığı uygun bir dalga boyunda (PS absorpsiyonununkiyle aynı) birleştiren antimikrobiyal Fotodinamik Terapi (aPDT) gibi alternatif tedavilere ihtiyaç vardır. PS'ler hücrelere bağlanır veya hücreler tarafından alınır ve ışıkla aktive edildiğinde, duyarlı hücreler için toksik olan reaktif oksijen türleri (ROS) üretir7.
aPDT'de kullanılan ışığa duyarlılaştırıcılardan (PS'ler) biri, zerdeçal bitkisinin (Curcuma longa L.) rizomlarından ekstrakte edilen doğal olarak oluşan bir bileşik olan kurkumindir (CUR). Kurkumin, anti-inflamatuar, antioksidan, antikanser ve antimikrobiyal yetenekler dahil olmak üzere çok sayıda terapötik özelliğe sahiptir 8,9. Daha önce yapılan bir araştırma, CUR kullanan aPDT'nin, konakçının dokularına herhangi bir zarar vermeden bir murin oral kandidiyazis modelinde C. albicans'ı etkili bir şekilde azalttığını buldu10. CUR, zerdeçaldan ekstrakte edilen ana kurkuminoiddir, ancak bu bitkide demetoksikurkumin ve bis-demetoksikurkumin gibi diğer polifenoller de bulunur. Kurkuminoid aracılı aPDT, kateterlerde büyütülen Staphylococcus aureus biyofilmlerine karşı antibakteriyel aktivite gösterdi11. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, C. albicans'a karşı antifungal aktivitesi belirsizliğini korumaktadır. Bu nedenle, bu çalışmada, bir murin OK modelinde C. albicans'a karşı bir kurkuminoid tuzun aracılık ettiği aPDT'yi değerlendirdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Farelerin kullanımına ilişkin araştırma protokolü, UNESP, Araraquara Diş Hekimliği Fakültesi'ndeki Hayvan Kullanımı Etik Kurulu (vaka numaraları 05/2008 ve 09/2020) tarafından onaylanmıştır. Referans suş olarak C. albicans (ATCC 90028) kullanıldı. Bu çalışma için vücut kütlesi 20-30 g olan altı haftalık dişi İsviçre fareleri (n = 45) kullanıldı. Hayvanlar São Paulo Eyalet Üniversitesi, UNESP, Botucatu tarafından sağlandı.
1. PS'nin hazırlanması ve aPDT için ışık kaynağının seçimi
- PS'yi test edilecek maddenin özelliklerine göre hazırlayın.
NOT: Bu çalışmada, PS olarak suda çözünür bir kurkuminoid karışımı (CUR bazlı suda çözünür tuz karışımı12) kullanılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu ve Şekil 1). 20 μM, 40 μM ve 80 μM'de (sırasıyla 15.6, 29.2 ve 58.4 mg/L) seyreltmeler, kullanımdan hemen önce ultra saf suda hazırlandı ve 5 °C'de tutuldu. - Dokuyu ısıtmadan ışığa duyarlı hedefin tamamını eşit ve aynı anda aydınlatabilen uygun bir dalga boyuna (PS absorpsiyonununkiyle aynı) sahip bir ışık ekipmanı seçin.
NOT: Bu çalışmada, Instituto de Física de São Carlos'ta (São Paulo Üniversitesi, São Carlos, SP, Brezilya) tasarlanan ışık yayan diyot (LED, bkz. Malzeme Tablosu) içeren bir el aleti kullanılmıştır. Işığın sağladığı çıkış gücü, yaklaşık 455 nm'lik mavi dalga boyunda 89,2 mW/cm2 idi.
2. C. albicans inoculum'un hazırlanması
- Referans suşu C. albicans (ATCC 90028) kullanana kadar -80 °C'de %50 gliserol ile maya-pepton-glikoz (YEPD, Malzeme Tablosuna bakınız) içinde saklayın.
- Donmuş suşu oda sıcaklığında çözdürün, kloramfenikol içeren Sabouraud dekstroz agar (SDA) içeren bir Petri kabına 100 μL'lik bir alikot yayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'de 48 saat inkübe edin.
- Beş koloniyi %2 glikoz (YNBg) ortamı ile 10 mL maya nitrojen suyuna aktarın ve 16 saat boyunca 37 ° C'de aerobik olarak büyütün.
- Maya kültürünü taze YNBg (1:10) içinde seyreltin ve optik yoğunluk büyümenin orta log fazına ulaşana kadar aerobik olarak 37 °C'de inkübe edin.
NOT: Daha önce her laboratuvar için mikrobiyal büyüme eğrisini standartlaştırın. Mevcut araştırmada, kültürlerin, 540 nm'de (OD540) optik yoğunluk ile gösterildiği gibi, ortalama değeri 0.536 ± 0.062 rastgele birim (ortalama ± standart sapma [SD]) ile gösterildiği gibi büyümenin orta log fazına ulaşana kadar yaklaşık 8 saat inkübe etmelerine izin verildi. - Kültürü oda sıcaklığında 5.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti aynı hacimde steril fosfat tamponlu salin (PBS; 0.136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, pH 7.4) ile iki kez yıkayın.
- PBS'de dört seri 10 kat seyreltme gerçekleştirmek için 100 μL alikot kullanın, seyreltmeleri SDA plakalarına yayın ve koloni sayımı için 37 ° C'de 48 saat inkübe edin. Standart olarak, mantar süspansiyonları mililitre başına yaklaşık 4.5 × 107 koloni oluşturan birim (CFU/mL)] konsantrasyonlarda kullanılır.
3. Farelerde OC indüksiyonu
NOT: Aşağıdaki metodoloji daha önce Takakura ve ark.13 tarafından tanımlanmış ve grubumuz10,14 tarafından bazı değişikliklerle yeniden üretilmiştir.
- Fareleri, aynı sayıda tedaviye karşılık gelen dokuz gruba (n = 5) rastgele dağıtın (Ek Dosya 1).
NOT: Farelerin ağız boşluğu Candida büyümesi için negatif olmalıdır. Bunun, ağız boşluğunu sürünerek ve numuneyi SDA üzerine kaplayarak kontrol edilmesi gerekir. - Hayvanları, zemin kaplaması için odun talaşı ilebirlikte propilen kutularda 10 (kutu başına en fazla 5 fare), 23 ± 2 ° C'de 12/12 saat aydınlık/karanlık döngüsü altında sıcaklık kontrollü bir vivaryumda tutun. Belirli bir zenginleştirmenin sağlanmasına gerek yoktur.
- Fareleri ekstrüde fare diyeti ve filtrelenmiş su ad libitum üzerinde tutun.
- İmmünsüpresif ilaç olan prednizolonu (100 mg/kg vücut ağırlığı, bkz . Malzeme Tablosu), ilk gün ilk kez C + L + 20, C + L + 40, C + L + 80, C + L - 20 μM, C + L- 40, C + L- 80, C-L + ve C-L- gruplarının tüm üyelerine deri altına enjekte edin (Ek Dosya 1).
NOT: Aynı gruptaki fareleri aynı kutuda tutun ve herhangi bir stres ve kilo kaybı belirtisi için günlük olarak izleyin. Stres veya kilo kaybı not edilirse analjezik veya değiştirilmiş yiyecek / su için veteriner tavsiyesi alın. - Birinci günden başlayarak ve deneyin sonuna kadar, içme suyunda 0.83 mg / mL'de tetrasiklin hidroklorür sağlayın13.
- C + L + 20, C + L + 40, C + L + 80, C + L- 20, C + L- 40, C + L- 80, C-L + ve C-L- (Ek Dosya 1) grupları dahil olmak üzere fare dillerini ikinci günde C. albicans inoculum ile aşılayın. Bu fareleri negatif kontrol grubundan (NCtrl) aşılamayın.
- Aşılamadan önce her uyluk kasına 10 mg / kg klorpromazin klorür (bkz . Malzeme Tablosu) intramüsküler enjeksiyonu ile hayvanları sakinleştirin.
- Steril bir swabı (hayvan başına bir tane) taze hazırlanmış (yani aşılamadan hemen önce hazırlanmış) standartlaştırılmış bir C. albicans süspansiyonuna batırarak farelerin ağız içi aşılamasını gerçekleştirin.
- Sakinleştirilmiş fareleri sırtüstü pozisyona getirin. Steril bir forseps kullanarak dillerini nazikçe ağızlarından çekin. Her farenin dilini ıslatılmış bir bezle 30 saniye ovalayın. Sedasyondan kurtulana kadar fareleri izleyin.
- Beşinci günde, immünosupresyonunu sürdürmek için tamamlayıcı bir deri altı prednizolon (100 mg / kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu uygulayın.
NOT: Bu protokol, ağız içi aşılamadan sonra enfeksiyonu 7 gün boyunca tutmak için yeterlidir. Protokol zaman çizelgesi Şekil 2'de gösterilmektedir.
4. Antimikrobiyal Fotodinamik Tedavi ve C. albicans'ın oral lezyonlardan kurtarılması
- Yedinci günde, tedaviden önce, ksilazin (10 mg / kg vücut ağırlığı) ile birlikte intraperitoneal ketamin hidroklorür (100 mg / kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu kullanarak hayvanları uyuşturun (bkz.
- Her hayvanı, ağzı açık tutmak için kesici dişlerin etrafına sarılabilen paslanmaz çelik tellerle donatılmış bir ped cihazı14,15 üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
NOT: Fareleri sakinleştirilirken ısıtmak, oda sıcaklığında hipotermiyi önlemek ve anesteziye bağlı ölümleri önlemek için izotermal pedler önerilir15. Anestezi uygulanan her hayvan, anestezi derinliğini doğrulamak için ayak parmakları sıkıştığında geri çekilme refleksinin olmaması ile izlenmelidir. Gerekirse orijinal dozun 1/3'ünde (ksilazin olmadan) bir idame dozu ketamin uygulanabilir. - Mandibula ve yanaklar geri çekildiğinde, dili nazikçe ağzın dışına yerleştirin.
- C+L+ gruplarından fareler için, dilin sırtına 70 μL PS pipetleyin (test edilen konsantrasyonlardan birinde). Fareleri ışınlama öncesi süre olarak 20 dakika boyunca karanlık bir ortamda tutun. Bu süre zarfında, ışığa duyarlılaştırıcının (PS) yutulmasını önlemek için her hayvanın dilinin ağız boşluğunun içinde kaldığından emin olun.
- Işığa duyarlılık döneminden sonra, aydınlatma için dili ağızdan dışarı çekin. LED cihazını dilin sırtına yerleştirin ve 37.5 J/cm2'de (mevcut cihazla 7 dakika) aydınlatın (Şekil 3).
- C+L- gruplarından hayvanlar için, dilin sırtında test edilen konsantrasyonlardan birinde 70 μL PS pipetleyin ve bu fareleri 27 dakika karanlıkta tutun.
- C-L+ grubundaki hayvanlar için (önceden herhangi bir ışığa duyarlılık olmadan ışıkla tedavi edilir), dilin sırtına 70 μL steril salin solüsyonu pipetleyin. Fareleri 20 dakika karanlıkta tutun ve ardından dillerini 37,5 J/cm2'de (mevcut cihazla 7 dakika) aydınlatın.
- C-L grubundan fareler için (ne PS ne de ışıkla muamele edilmemiş), dilin sırtına 70 μL steril salin solüsyonu pipetleyin ve 27 dakika karanlıkta tutun.
- Tedaviden hemen sonra C. albicans'ı tüm farelerin dillerinden kurtarın. Dilin sırtını steril bir pamuklu çubukla 1 dakika boyunca temizleyin.
- Her numune swabını 1 mL steril salin içeren bir tüpe yerleştirin ve mikrobiyal hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 dakika boyunca girdap yapın.
- Hemen PBS'de 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin ve SDA plakaları üzerinde 25 μL'lik alikotları çoğaltın. Plakaları aerobik olarak 37 °C'de 48 saat inkübe edin.
- 48 saat sonra, maya koloni sayımlarını belirlemek için dijital bir koloni sayacı ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. Her hayvan için C. albicans yükünü (CFU/mL) hesaplayın.
- CFU/mL değerlerini log10'a dönüştürün ve deneyin tasarımına ve veri varsayımlarına göre uygun şekilde analiz edin.
NOT: Bu çalışmada Welch'in tek yönlü ANOVA ve Games-Howell post-hoc testi (α = 0.05)16 kullanılmıştır.
5. Histopatolojik analizler
- Sekizinci günde, fareleri intraperitonial enjeksiyon yoluyla 10 mg / kg'da ksilazin ile birlikte 100 mg / kg'da ketamin ile uyuşturun ve aşırı dozda ketamin (intraperiotoniyal yoluyla uygulanan 200 mg / kg) ile ötenazi yapın. Solunum hareketinin (apne) ve kalp atışının (asistol) yokluğunu kontrol ederek ölümü onaylayın.
- Dili dikkatlice sıkıştırın ve hayvanın ağzından dışarı çekin. Manuel bir neşter kullanarak, ön ve orta bölgelerde herhangi bir yaralanmaya neden olmadan tüm dili cerrahi olarak çıkarmak için sirkumvalat papilladan önce bir kesi yapın.
- Dili 24 saat boyunca% 10 tamponlu formalin (pH 7.2-7.4) içinde sabitleyin ve 2 saat boyunca akan suda yıkayın.
- Parafin işlemine dahil edilmeye devam edin: dehidrasyon, berraklaştırma ve emprenye10,14.
- Bir mikrotom kullanarak seri bölümleri (5 μm kalınlığında) kesin, ardından bölümleri cam slaytlara yapıştırın. Histopatolojik inceleme ve ışık mikroskobu altında gözlem yoluyla mantarları tanımlamak için periyodik asit-Schiff ve hematoksilen (PAS-H) kullanarak bu bölümleri boyamaya devam edin.
- C. albicans enfeksiyonuna bağlı doku reaksiyonunu incelemek için tercihen çalışılan gruplara kör olan bir patoloğa danışın.
- Dokunun histolojik özelliklerini (epitel ve bağ dokusu), özellikle değişen yoğunluklarda lokal inflamatuar yanıtları tanımlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OC'nin murin modeli, tüm enfekte farelerin dilinde tipik beyaz lekeler ve psödomembranlar gösterdi (Şekil 4A). C-L-hayvanlarından elde edilen C. albicans , bu mikroorganizma tarafından doku kolonizasyonunu doğruladı (değerler 1.62 x 104 ila 4.80 x 105 CFU/mL arasında değişiyordu). Beklendiği gibi, NCtr grubundaki hayvanlar, örneklemeden sonra herhangi bir doku değişikliği veya koloni büyümesi göstermedi (Şekil 4B).
aPDT, ışığa duyarlılık için 80 μM'de kurkuminoidler kullanıldığında C. albicans'ın canlılığını azaltmıştır (Şekil 5). 80 μM PS aracılı aPDT ile elde edilen ortalama log10 azalma, C-L- grubundakine kıyasla 2.47 idi (p = 0.008).
Fare dillerinden elde edilen C. albicans kolonilerinin sayısı, aydınlatmasız kurkuminoidlerle tedavi edilen fareler (C + L- grupları), ışıkla tedavi edilen ancak daha önce ışığa duyarlı hale getirilmemiş fareler (C-L + grupları) ve tedavi edilmemiş fareler (C-L- grubu) arasında önemli ölçüde farklı değildi (p ≥ 0.210).
Enfekte olmamış hayvanların dillerinin histolojik özellikleri (NCtr), sağlam lamina propria, bazal membran ve filiform papilla dahil olmak üzere normal/sağlıklı dokular gösterdi (Şekil 6A). Buna karşılık, C-L- grubundan farelerin dillerinin histopatolojik görüntüleri incelendiğinde, mantar infiltrasyonu olmamasına rağmen, epitelin keratinize tabakasında maya ve filamentlerin mevcut olduğu açıktı. Altta yatan bağ dokusunda, esas olarak mononükleer hücrelerin aracılık ettiği hafif bir inflamatuar yanıt gözlendi ve filiform papillalar özellikle yoktu (Şekil 6B). Hem C+L- hem de C-L+ gruplarındaki farelerin dillerinin histolojik analizi benzer özellikler gösterdi. Buna karşılık, 80 μM kurkuminoid aracılı aPDT ile tedavi edilen farelerin dil bölümleri, esas olarak epitelin keratinize tabakası ile sınırlı olan azaltılmış sayıda mantar hücresi ortaya çıkardı (Şekil 6C).
Şekil 1: Işığa duyarlılaştırıcının kimyasal yapısı. Işığa duyarlılaştırıcı olarak kullanılan suda çözünür tuz karışımının kimyasal yapısı, %53.4 doğal kurkumin ve %46.6 diğer kurkuminoidlerden (demetoksikurkumin ve bis-demetoksikurkumin) oluşur. Nihai ortalama moleküler ağırlık 730.32 g/mol'dür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Oral kandidiyazis ve aPDT'nin murin modeli için protokol zaman çizelgesi. Oral kandidiyazis ve antimikrobiyal fotodinamik tedavinin (aPDT) murin modeli için protokolü özetleyen bir zaman çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Işığa duyarlılıktan sonra fare dillerinin aydınlatılması. Işığa duyarlılıktan sonra (enfekte dokunun ışığa duyarlılaştırıcı ile inkübasyonu), diller mavi (~455 nm) bir LED ışık kullanılarak 37.5 J /cm2'de aydınlatıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Murin oral kandidiyazis modelinde beyaz lezyonlar. (A) Oral kandidiyazisin murin modelinde gözlenen beyaz lezyonları gösteren temsili görüntüler. (B) Negatif (enfekte olmayan) kontrol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Candida albicans farelerin dillerinden elde edildi. Veriler, tedavi gruplarından log10'un (CFU / mL) standart sapması ± ortalama değerleri temsil eder. Welch'in tek yönlü varyans analizi, tedavilerin etkilerinin gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdiğini gösterdi (p < 0.001). Ortalamaların yanındaki farklı küçük harfler (a, b, c) Games-Howell testine göre istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermektedir (p≤ 0.030). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Fare dillerinin histolojik bölümlerinin temsili görüntüleri. Fare dillerinin histolojik kesitleri PAS-H ile boyandı ve görüntüler 200x'te yakalandı. (A) İndüklenmiş oral kandidiyazis, ışığa duyarlılık ve aydınlatma olmayan negatif kontrol fareleri (NCtr grubu). (B) İndüklenmiş oral kandidiyazisli fareler, ne ışığa duyarlı ne de LED aydınlatmaya maruz kalır (CL grubu). (C) 80 μM kurkuminoidlere ve 37.5 J /cm2 LED aydınlatmaya maruz kalmış indüklenmiş oral kandidiyazisli hayvanlar (C + L + 80 grubu). Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Deney grupları. Bu çalışmada kullanılan deney gruplarının bir listesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. albicans, bağışıklığı baskılanmış bir durum, diabetes mellitus, uzun süreli antibiyotik kullanımı ve kötü ağız hijyeni olan bireylerde oral ve özofagus enfeksiyonları ile ilişkilendirilmiştir 1,3. İnsan bulaşıcı hastalıklarının incelenmesi, klinik deneylerin güvenli ve doğru bir şekilde tasarlanabilmesi için hem in vitro hem de in vivo araştırmalar gerektirir. Bu çalışmada, C. albicans tarafından oral enfeksiyonların patogenezini ve antifungal yaklaşımların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilecek bir OK fare modeli oluşturmak için bir yöntem tanımlanmaktadır 15,16,17,18,19.
Burada kullanılan OK'nin murin modeli, enfekte farelerin dillerinin makroskopik ve histopatolojik analizlerinde gözlenen karakteristik enfeksiyon özelliklerinin yanı sıra lezyonlardan önemli mantar yükü geri kazanımı ile kanıtlandığı gibi başarılı bir şekilde oluşturulmuştur. Birçok çalışmada OC'nin benzer murin modelleri kullanılmıştır. Bu tür modellerde, dişi fareler immünosuprese edilir ve C. albicans ile aşılanır, bu da dildelezyonlara neden olur 10,13,14,15,20,21. Bir glukokortikoid olan prednizolon ile immünosupresyon, nötrofillerin C. albicans22'ye karşı aktivitesini inhibe eder. Bu çalışmada, dişi fareler, enfeksiyondan bir gün önce ve üç gün sonra iki deri altı prednizolon enjeksiyonu ile immünosuprese edildi C. albicans13. Ek olarak, deney sırasında içme suyuna tetrasiklin verilmesi, oral bakterileri rahatsız ederek ve C. albicans'ın gelişmesine yardımcı olarak oral disbiyozise neden olmuştur23,24. Ayrıca, kas içi klorpromazin klorür enjeksiyonunun neden olduğu sedasyon, hayvanların aşılamadan hemen sonra su içmesini ve yemek yemesini engelledi. Böylece mantar hücreleri dilin dorsumuyla daha uzun süre temas halinde kalarak germ tüplerinin gelişmesini ve mayalardan insan epitelini istila edebilen C. albicans'ın patojenik morfolojileri olan filamentlere (hif ve psödohif) geçişi sağladı. Teichert ve ark.25, farelerde OC'yi indüklemek için bir immün yetmezlik protokolü kullandı ve sadece 2 x 102 CFU / mL C. albicans geri kazandı.
Totti ve ark.26 sialoadenektomize fareler kullanmış ve bir C. albicans süspansiyonu ile dört ayrı aşılama gerçekleştirmiş olsa da, onların durumunda, deney boyunca çoğu hayvanda enfeksiyonun sürdürülmemesi dikkat çekicidir. Buna karşılık, bu çalışmada, mantar hücreleri ile aşılama sadece bir kez gerçekleştirildi ve ağız boşluğundan 104 CFU / mL C. albicans'ın geri kazanılmasıyla sonuçlandı. Bu çalışmada, kutanöz kandidiyazisli bir hastadan (106 CFU / mL) izole edilen bir klinik suşla oral aşılama yapan Takakura ve ark.13 tarafından tanımlanan kandidiyazisin murin modeli kullanılmıştır. Aşılamadan üç ila yedi gün sonra, farelerin13 ağız boşluğundan 105-10 6 CFU / mL C. albicans geri kazanıldı. Takakura ve ark.13 yöntemi ile bu çalışma arasındaki farklar, aşılamada farklı mantar konsantrasyonlarının kullanımını (bu çalışmada 107 CFU / mL C. albicans kullanılmıştır) ve oral aşılama için farklı C. albicans suşlarının (referans suşu ATCC 90028 kullanılmıştır) içerir. Carmello ve ark.20, bağışıklığı baskılanmış hayvanların kullanılmasını içeren benzer bir protokol kullandı. Bununla birlikte, deneyin 1, 5, 9 ve 13. günlerinde hayvanlara iki ek deri altı prednizolon enjeksiyonu uyguladılar. Çalışmaları, enfekte hayvanların oral lezyonlarına atanan puanlar ile enfeksiyondan sonraki 5 ila 16 gün arasında değişen bir süre boyunca CFU / mL sayısı arasında pozitif bir korelasyon olduğunu ortaya koydu. Hipotermiyi önlemek için anestezi altındaki hayvanları yakından izlemenin çok önemli olduğu önceki araştırmalarda iyi bilinmektedir. Ek idame dozları ketamin ihtiyatlı bir şekilde, sadece gerektiğinde uygulanmalıdır27.
aPDT uygulamasının etkinliği ile ilgili olarak, sonuçlar, daha önce 80 μM kurkuminoid tuz karışımı ile muamele edilen dillerin ışınlanmasının, C. albicans'ın canlılığında önemli bir azalmaya (2.47 log10) neden olduğunu göstermiştir. Histolojik analizler, 80 μM kurkuminoid aracılı aPDT ile tedavi edilen dillerden alınan bölümlerin, keratinize tabaka ile sınırlı olan mantar hücrelerinin sayısının azaldığını ve düşük inflamatuar yanıt gösterdiğini ortaya koydu. C. albicans ile enfekte olan tüm farelerde inflamatuar bir yanıt tespit edildiğini vurgulamakta fayda var. Bu gözlem, tüm aPDT gruplarında gözlenen inflamasyonun, önceki araştırmalarımız10,13,14,15 ile uyumlu bir bulgu olan aPDT'ye atfedilmek yerine Candida enfeksiyonu ile bağlantılı olabileceğini ima etmektedir.
Önceki araştırmalarda PS olarak CUR, metilen mavisi ve fotoditazin (PDZ) kullanılmış ve umut verici sonuçlar eldeedilmiştir 10,20,24,25,27. Benzer bir çalışmada10, CUR ve LED ışığına kombine maruz kalma, C. albicans'ın canlılığında önemli bir azalmaya neden oldu; bununla birlikte, 80 μM CUR ve ışık kullanımı, mantar canlılığını 4.0 log10 azaltmıştır. Dovigo ve ark.10 PS olarak sadece CUR kullanırken, biz C. longa'dan üç ana kurkuminoid içeren bir tuz kullandık. Farelerde oral kandidiyazis tedavisinde art arda beş gün boyunca CUR (260 μM) ve LED ışık kullanıldığında, yazarlar mantar canlılığında 1.11 log10'luk bir azalma gözlemlediler21. Metilen mavisi 450 μg/mL ve 500 μg/mL'de PS olarak kullanıldığında, aPDT farelerin ağız boşluğundan C. albicans'ı tamamen yok etti25. Ayrıca, aPDT'ye PDZ (100 mg/L) aracılık ettiğinde, oral lezyonların 3.0 log10 azalması ve tam remisyon gözlendi20. Ek olarak, aPDT, tedavi edilmeyen grup20'ye kıyasla TNF-α ekspresyonunu arttırdı. Flukonazole dirençli bir suşun kullanıldığı bir çalışmada, PDZ'nin (200 mg / L) aracılık ettiği aPDT, 1.3 log1027'ye eşdeğer bir azalmayı destekledi. Ayrıca, aPDT'nin nistatin ile kombinasyonu, oral lezyonlarda kayda değer iyileşmeler ve inflamatuar yanıtta bir azalma ile birlikte 2.6 log10'luk bir azalmaya neden olan mantar canlılığında önemli bir azalmaya neden oldu27. Toplu olarak, bu çalışmalar, oral kandidiyazisin murin modelinde mantar yükünü azaltmada aPDT'nin etkinliği için ikna edici kanıtlar sağlar ve konakçı dokulara zarar vermeden antimikrobiyal etkinliği nedeniyle klinik bir tedavi seçeneği olarak potansiyelinin altını çizer.
Sonuç olarak, bu çalışmada kullanılan OK'nin murin modeli, enfeksiyonu taklit etmek ve aPDT etkinliğini değerlendirmek için uygundur. Bir sınırlama olarak, burada kullanılan OC modeli, C. albicans'ın yalnızca bir referans suşunu kullanmıştır (diğer suşlar, klinik izolatlar ve albicans olmayan Candida türleri değerlendirilmemiştir). Ek olarak, farelerde oral enfeksiyon geliştirmek için kullanılan kortikosteroid kaynaklı immünosupresyon, HIV enfeksiyonu gibi diğer immün yetmezlik durumlarını taklit etmeyebilir. Farelerin ve insanların oral mikrobiyotası gibi OC gelişimi için konak koşullarında da farklılıklar olabilir. Bu protokol, birden fazla tür veya aynı türden farklı suşlar tarafından oluşturulan karışık biyofilmleri değerlendirmek için daha da genişletilmelidir. Ayrıca, fareleri yeterince sedasyonda tutmak ve anesteziye bağlı mortaliteyi önlerken hipotermiyi önlemek protokolün en zor adımlarıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar, FAPESP (São Paulo Araştırma Vakfı, süreç numarası FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) ve 2008/00601-6'nın mali desteğine teşekkür eder. Ayrıca CUR bazlı suda çözünür tuz hakkında bilgi verdiği için Dr. Ana Paula Silva'ya teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
References
- Vila, T., Sultan, A. S., Montelongo-Jauregui, D., Jabra-Rizk, M. A. Oral candidiasis: a disease of opportunity. Journal of fungi (Basel, Switzerland). 6 (1), 15 (2020).
- Sudbery, P. E.
- Moyes, D. L., Richardson, J. P., Naglik, J. R. Candida albicans-epithelial interactions and pathogenicity mechanisms: scratching the surface. Virulence. 6 (4), 338-346 (2015).
- Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
- Quindós, G., et al. Therapeutic tools for oral candidiasis: Current and new antifungal drugs. Medicina oral, patologia oral y cirugia buccal. 24 (2), e172-e180 (2019).
- Nishimoto, A. T., Sharma, C., Rogers, P. D. Molecular and genetic basis of azole antifungal resistance in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (2), 257-270 (2020).
- Gholami, L., Shahabi, S., Jazaeri, M., Hadilou, M., Fekrazad, R. Clinical applications of antimicrobial photodynamic therapy in dentistry. Frontiers in Microbiology. 13, 1020995 (2013).
- Trigo-Gutierrez, J. K., Vega-Chacón, Y., Soares, A. B., Mima, E. G. O. Antimicrobial activity of curcumin in nanoformulations: a comprehensive review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7130 (2021).
- Santezi, C., Reina, B. D., Dovigo, L. N. Curcumin-mediated Photodynamic Therapy for the treatment of oral infections-A review. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 409-415 (2018).
- Dovigo, L. N., et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis. Medical Mycology. 51 (3), 243-251 (2013).
- Zangirolami, A. C., Carbinatto, F., Filho, J. D. V., Bagnato, V. S., Blanco, K. C. Impact of light-activated curcumin and curcuminoids films for catheters decontamination. Colloids and SurfacesB: Biointerfaces. 213, 112386 (2022).
- Santezi, C., Tanomaru, J. M., Bagnato, V. S., Júnior, O. B., Dovigo, L. N. Potential of curcumin-mediated photodynamic inactivation to reduce oral colonization. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 15, 46-52 (2016).
- Takakura, N., et al. A novel murine model of oral candidiasis with local symptoms characteristic of oral thrush. Microbiology and immunology. 47 (5), 321-326 (2003).
- Mima, E. G., et al. Susceptibility of Candida albicans to photodynamic therapy in a murine model of oral candidosis. OralSurgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. 109, 392-401 (2010).
- Solis, N. V., Filler, S. G.
- Marôco, J. Análise Estatística com o SPSS Statistics 25. , ReportNumber 7th ed, Lisboa, Portugal. (2018).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L. Jr, Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS Microbiology Letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Experimental oral candidiasis in animal models. Clinical Microbiology Reviews. 14, 398-429 (2001).
- Chamilos, G., Lionakis, M. S., Lewis, R. E., Kontoyiannis, D. P. Role of mini-host models in the study of medically important fungi. The Lancet Infectious Diseases. 7, 42-55 (2007).
- Carmello, J. C., et al. Treatment of oral candidiasis using Photodithazine- mediated photodynamic therapy in vivo. PLoS One. 11 (6), e0156947 (2016).
- Sakima, V. T., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by curcumin-loaded polymeric nanoparticles in a murine model of oral candidiasis. Molecules. 23 (8), 2075 (2018).
- Abe, S., et al. A glucocorticoid antagonist, mifepristone affects anti-Candida activity of murine neutrophils in the presence of prednisolone in vitro and experimental candidiasis of prednisolone-treated mice in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 13 (4), 311-316 (1996).
- Jones, J. H., Russell, C., Young, C., Owen, D. Tetracycline and the colonization and infection of the mouths of germ-free and conventionalized rats with Candida albicans. Journal Antimicrobial Chemotherapy. 2 (3), 247-253 (1976).
- Russell, C., Jones, J. H. Effects of oral inoculation of Candida albicans in tetracycline-treated rats. Journal of Medical Microbiology. 6 (3), 275-279 (1973).
- Teichert, M. C., Jones, J. W., Usacheva, M. N., Biel, M. A. Treatment of oral candidiasis with methylene blue- mediated photodynamic therapy in an immunodeficient murine model. OralSurgery, Medicine, Pathology, Radiology and Endodontology. 93, 155-160 (2002).
- Totti, M. G. A., Santos, E. B., Almeida, O. P., Koga-Ito, C. Y., Jorge, A. O. C. Oral candidosis by Candida albicans in normal and xerostomic mice. Brazilian Oral Research. 18, 202-207 (2004).
- Hidalgo, K. J. R., et al. Antimicrobial photodynamic therapy in combination with nystatin in the treatment of experimental oral candidiasis induced by Candida albicans resistant to fluconazole. Pharmaceuticals (Basel). 12 (3), E140 (2019).
