Summary
Detta arbete beskriver användningen av en flotationsmetod för att identifiera Toxocara canis och Ancylostoma spp. som påvisats i avföringsprover som samlats in från hundar i Mexiko från 2017 till 2021 under fältförhållanden.
Abstract
Diagnos av hundparasiter med zoonotisk potential som Toxocara canis och Ancylostoma caninum under fältförhållanden är vanligtvis svår på grund av begränsad tillgång till ett laboratorium på landsbygden och i förortsområden i Mexiko. Denna studie syftade till att upptäcka T. canis och Ancylostoma spp. i avföringsprover som samlats in från hundar i Mexiko från 2017 till 2021 under fältförhållanden. Beräkningen av urvalsstorleken resulterade i en målinskrivning på 534 hundar över hela landet.
Prover togs direkt från ändtarmen eller marken efter avföring. Proverna förvarades i enskilda, tätt förslutna plastpåsar vid 4 °C. En mättad lösning av natriumklorid (specifik vikt [SpG] 1,20) bereddes både under fält- och laboratorieförhållanden. Inom 3 dagar efter insamlingen testades 2-4 g avföring för parasiter med hjälp av en flotationsmetod genom att suspendera varje fekalt prov i en saltlösning. Avföring blandades med flytlösningen och krossades med en metallsked.
När en enhetlig konsistens hade uppnåtts hälldes avföringsprovet i en ny plastmugg med hjälp av en sil och fick sitta i 10-15 minuter. Tre droppar från toppen av blandningen samlades upp med hjälp av en steriliserad inokuleringsslinga. Objektglasen placerades i mikroskop och parasiter identifierades av utbildade parasitologer. Avföringsprover från 1 055 hundar screenades mikroskopiskt. Antalet positiva prover för Ancylostoma spp. var 833 (78,95 % frekvens) och 222 (21,04 %) för T. canis. Dessa fynd illustrerar vikten av att identifiera zoonotiska maskar hos hundar som lever i stads- och landsbygdsområden i Mexiko med hjälp av en koproparasitoskopisk teknik i laboratoriet och under fältförhållanden.
Introduction
Gastrointestinala parasiter är ett av de vanligaste hälsoproblemen som drabbar hundar1. Uppskattningar tyder på att det finns ~700 miljoner tamhundar i världen, och cirka 175 miljoner kan kategoriseras som fritt strövande2. Mer än 60 parasitarter delas mellan hundar och människor, vilket tyder på att hundar kan vara en infektionskälla för människor med dessa parasiter. Toxocara canis och Ancylostoma caninum är två parasitarter som infekterar hundar och, av misstag, mänskliga värdar. För närvarande finns det flera studier om de platser där dessa maskar kan överleva och föröka sig i Mexiko. Prevalensen av Toxocara hos hundar varierar från 0 % till över 87 % i USA, Mexiko, Centralamerika och Karibien4. Toxocara canis och Ancylostoma spp., liksom andra parasitarter hos hundar, har tidigare rapporterats i Mexiko 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (tabell 1).
| Parasitiska arter | Region | Prevalens (%) | Hänvisning |
| Ancylostoma caninum | Querétaro | 42.90 | 5 |
| Tabasco | 15.90 | 6 | |
| Campeche | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| Yucatán Yucatán | 73.8 | 8 | |
| Babesia | Morelos | 13.60 | 9 |
| Veracruz | 10.00 | ||
| Koccidiala oocystor | Yucatán Yucatán | 2.30 | 8 |
| Ctenocephalides | Morelos | 30.3 | 10 |
| Dipylidium caninum | Yucatán Yucatán | 2.30 | 8 |
| Dirofilaria Dirofilaria | Yucatán Yucatán | 7.0 – 8.3 | 11 |
| Giardia | Tabasco | 3.00 | 6 |
| Yucatán Yucatán | 18.8 | 8 | |
| Leishmania | Chiapas | 19.00 | 12 |
| Bandmaskar | Baja California | 6.79 | 13 |
| Toxocara canis | Querétaro | 22.10 | 5 |
| Yucatán Yucatán | 6.20 | 8 | |
| Trichuris vulpis | Yucatán Yucatán | 25.40 | 8 |
| Trypanosoma | Jalisco | 8.10 | 9 |
| Campeche | 7.60 | ||
| Chiapas | 4.5 – 42.8 | ||
| Quintana Roo | 20.1 – 21.3 | ||
| Toluca | 17.50 | ||
| Yucatán Yucatán | 9.8 – 34 |
Tabell 1: Regional prevalens (%) av hundparasiter i Mexiko från 2001 till 2020. Resultat från tidigare undersökningar som genomförts mellan 2001 och 2020 har gjort det möjligt att identifiera spridningen av hundparasiter i flera stads- och landsbygdsmiljöer i Mexiko. Dessa studier ger en djup förståelse för epidemiologiska faktorer som bidrar till hundparasiters överlevnad i olika ekosystem, vilket bidrar till en omfattande bedömning av de zoonotiska effekterna av vissa parasitarter.
Livscykelstadier av tarmparasiter, såsom ägg, cystor, oocystor eller larver kan hittas i avföringsprover. Således ger undersökning av avföringsmaterial värdefull information om parasiterna hos ett djur. Behovet av en metod för att upptäcka Ancylostomidae-ägg i mänsklig avföring ledde till användningen av det enkla avföringsutstryket 1878, som användes i många år för att upptäcka gastrointestinala parasiter men som inte ansågs vara särskilt känsligt. Således uppstod ett behov av att utveckla bättre kopromikroskopiska metoder14. Mer än 100 år har gått sedan flotationstekniken för att ta tillvara och räkna parasitägg i fekala prover först beskrevs15. Sedan dess har flera metoder och varianter av flotationstekniken ansetts vara en standard för att upptäcka vissa parasiter hos sina värdar.
Till exempel beskrev Lane 1924 en metod som involverade den direkta centrifugalflotationstekniken, som integrerar centrifugering följt av att sedimentet flyter i en mättad natriumkloridlösning med SpG 1,2 i 1 g (Lane) eller 10 g (Stolls modifiering). Flotationstekniken modifierades sedan genom att använda lösningar med olika SpG14. År 1939 rapporterade Gordon och Whitlock om nackdelarna med Stolls teknik på grund av störningar från detritus vid visualisering av parasitägg och utvecklade den kvantitativa metoden känd som McMaster16. År 1979 visade O'Grady och Slocombe att lösningens specifika vikt, tidpunkt och maskstorlek för silar påverkar noggrannheten i äggdetektering med hjälp av flotationstekniken17. Under de senaste decennierna, eftersom flera modifieringar har gjorts av flotationstekniken, finns det ett akut behov av standardisering av flotationsmetoder. För närvarande krävs detektion av maskinfektioner hos hund i samband med förebyggande av zoonotiska parasiter för att lämpliga avmaskningsbehandlingar ska kunna tillämpas för att begränsa miljökontaminering med infektiösa stadier av zoonotiska nematoder18.
Bland kvalitativa metoder används fekal flotationsteknik i stor utsträckning och accepteras eftersom den inte kräver mycket utrustning, är enkel, billig och reproducerbar; Ändå har den en stor nackdel i och med att den saknar känslighet när infektionens intensitet är låg19. Förmågan att avslöja närvaron av ett större antal parasitiska element såsom ägg, oocystor, cystor eller nematodlarver bestäms vanligtvis av lösningens densitet20.
Tidigare rapporter har jämfört koproparasitologiska tekniker för detektion av hundnematodägg. När det gäller detektion av rörliga protozoer används direkta fekala utstryk; Sedimenteringsmetoder är användbara för att diagnostisera tunga ägg av parasiter som trematoder21. Ett av de mest använda fältbaserade diagnostiska testerna är fekalt cellprovsmetoden. Den låga känsligheten hos denna teknik kan dock tillskrivas det faktum att den innehåller skräp som stör upptäckten av parasitägg. Genom att införliva ett siktningssteg tillsammans med lösningar som ger rätt SpG, erbjuder flotationsmetoden en tydligare och mindre rörig observation av askarider och hakmaskägg. Detta leder till en mer exakt och effektiv process för mikroskopisk screening22. På samma sätt är enkla flotations- och direkta centrifugalflotationstekniker mycket vanliga för att återvinna parasitägg och oocystor14. De klassiska flotationsmetoderna kan betraktas som kvalitativa eller kvantitativa beroende på användningen av en räknekammare som McMaster-metoden15. Icke desto mindre, eftersom flotationstekniken har låg känslighet och fokuserar på detektion av parasiter under patentperioden, bör negativa resultat inte betraktas som avgörande. Noggrannheten beror dock inte bara på konserveringsproceduren för fekala prover eller SpG för flytlösningar utan beror också på användarens tekniska skicklighet och erfarenhet av att utföra fekala undersökningar.
Därför har andra metoder undersökts för att upptäcka hundparasiter i avföringen. Det har varit allmänt erkänt att en av de mest använda metoderna för diagnos av tarmmaskinfektioner hos hundar är FLOTAC-tekniken, en multivalent, känslig och noggrann metod som ger exakta och tillförlitliga resultat för diagnos av A. caninum hos hundar jämfört med ett flotationsprotokoll i ett rör och McMaster-tekniken19, 23. veckor Sedimentationsmetoder är användbara för att återvinna fluke-ägg, embryonerade nematodägg och de flesta bandmaskägg, som inte kan återvinnas på ytan av en flotationslösning eftersom dessa strukturer inte flyter24. En metod som har visat sig vara överlägsen flotations-/sedimenteringstekniker är den modifierade dubbelcentrifugalflotationsmetoden, eftersom den möjliggör detektion av cestodägg i avföring, är mindre tidskrävande, separerar Anoplocephala-ägg från fekalt skräp och minskar kristallisationen25. Dessutom har denna teknik framgångsrikt använts för att upptäcka askarider med hög känslighet26. Ändå kräver några av dessa ovan nämnda tekniker och centrifugalmetoder som Ovassay, i motsats till flotationsprotokollet vi föreslår i denna studie, provkonservering i reagenser som formalin, kommersiella kit, provbearbetning under laboratorieförhållanden och användning av reagenser som zinksulfat27 som är dyra och kräver särskilda bortskaffningsprocedurer för att undvika miljötoxicitet.
Användningen av tekniker som ökar flotationsmetodens känslighet genom att tillsätta lösningar med hög SpG har gynnats på senare tid. Det måste dock beaktas att nackdelen med dessa lösningar är ökningen av skräp i den slutliga beredningen och därmed den felaktiga upptäckten av parasitägg. Dessutom påverkar den kommersiella tillgängligheten av material, reagenser, kostnad, miljöpåverkan och svårigheten att använda centrifugalmetoder valet av flotationsteknik14, vilket kan vara utmanande under fältförhållanden i motsats till det protokoll som vi presenterar i detta arbete. Beredningen av flotationslösningarna med bordssalt är fördelaktig jämfört med användningen av socker eftersom socker under fältförhållanden lockar till sig insekter som getingar och bin och preparaten blir klibbiga. Vidare är lösningar som fenol, som tillsätts till sockerlösningar för att undvika klibbighet, eller ZnSO4komplexa att kassera korrekt enligt miljöskyddsriktlinjer och kan inte kasseras på fältet; till skillnad från en bordssaltlösning.
Målet med detta manuskript är att demonstrera stegen för att detektera T. canis och Ancylostoma spp. ägg i fekala prover med hjälp av en anpassning av den enkla flotationstekniken under fält- och laboratorieförhållanden. I enlighet med det protokoll som beskrivs härmed och med hjälp av ett mikroskop med ett reservbatteri är det möjligt att diagnostisera dessa zoonotiska hundparasiter på landsbygden och i förortsområden när ingen laboratorieutrustning och infrastruktur finns tillgänglig. Den enkla flytmetoden som beskrivs i detta arbete kan ge snabba resultat och är en icke-invasiv och kostnadseffektiv teknik för rutinmässig screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användning och skötsel av hundar godkändes av National and Autonomous University of Mexico.
1. Insamling av fekala prover
OBS: Hantera hunden med hjälp av veterinär eller djurets ägare.
- När det gäller förvildade hundar (figur 1A) eller nervösa djur ska prover tas från marken omedelbart efter avföring eller senast 10 minuter senare.
- Smörj operationshandskar eller tunnväggiga polyetenpåsar med vatten eller vaselin. För att samla in avföringsprover från ändtarmen, använd kirurgiska handskar eller tunnväggiga polyetenpåsar.
- Samla in minst 2 g avföring från varje hund (Figur 1B).
- Identifiera enskilda avföringsprover enligt följande: datum, plats (GPS-koordinater med hjälp av Google Maps), tilldela ett identifikationsnummer för varje djur, ungefärlig ålder på hunden, kön på hunden, ras, inomhus- eller utomhushund (vild).
- Stäng påsarna med avföringsprovet med en tät knut. Förvara påsarna i kylskåp (4-8 °C) om avföringsprover inte analyseras inom 3-4 timmar efter insamling.
2. Beredning av en mättad saltlösning för fältdiagnos
OBS: Om tillgång till en våg, mätmaterial, spisar eller gas för att koka vatten saknas eller är begränsad, kan den mättade saltlösningen enkelt beredas med vatten, vanligt bordssalt, en plastkopp på 12 oz (355 ml) och en tom flaska av 1 L sodaplast.
- Tvätta noggrant en tom 1 L läskflaska. Fyll flaskan med 1 liter vatten.
- Fyll en 12 oz plastmugg med vanligt bordssalt.
- Överför saltet till läskflaskan.
- Stäng läskflaskan ordentligt med skruvlocket. Skaka lösningen kraftigt tills saltet inte längre löser sig.
OBS: Att skaka lösningen i läskflaskan tills saltet är helt upplöst kan ta upp till 90 minuter.
3. Beredning av en mättad saltlösning för laboratoriediagnostik
- Väg upp 420 g vanligt bordssalt.
- Lös upp 420 g salt i 1 liter vatten.
- Koka lösningen tills inget mer salt löser sig.
- Filtrera lösningen för att kassera det olösta saltet.
- Kontrollera koncentrationen av lösningen med en tungvätskehydrometer eller densitometer.
OBS: Den ideala koncentrationen har en SpG på 1.20 för att uppnå bättre resultat (Figur 2A). Ett äggs flytförmåga påverkas av dess interaktion med lösningen, vilket bidrar till äggens varierande förmåga att flyta i lösningar med samma specifika vikt. För att uppnå optimal äggåterhämtning är det därför viktigt att ta hänsyn till det övre intervallet för specifik vikt i flotationslösningen, vilket säkerställer att den överträffar den för de riktade parasitelementen6.
4. Flotationsmetod
OBS: Om avföringsprover är för torra eller hårda, macerera dem i en mortel.
- Använd en sked och lägg cirka 3 g avföring i en plastmugg (~8,5 cm i höjd och ~5,5 cm i diameter).
- Tillsätt 1 ml av den mättade saltlösningen tills en pasta erhålls.
- Rör om i 1 minut och tillsätt 100 ml mättad saltlösning.
- För suspensionen genom en plastsil till en andra plastmugg för att undvika grova partiklar (figur 2B).
- Låt upphängningen stå i 15-20 min.
- Placera en inokuleringsslinga i en låga i 1 s för att säkerställa att den är fri från ägg, cystor eller oocystor (Figur 2C).
- Vänta i 5 sekunder tills inokuleringsslingan har svalnat (Figur 2D).
- Ta tre droppar från suspensionens yta med inokuleringsöglan. Placera var och en av de tre dropparna separat på ett glasglas (Figur 2E-G)
OBS: Se till att dropparna inte är i kontakt med varandra (Figur 2H). - Observera under mikroskopet med ett 10x objektiv (Figur 2I). Placera ett täckglas om förstoringen ökas till 40x.
- När ett positivt resultat observeras i droppen, tilldela ett kryss (+) i laboratorieloggboken för att registrera förekomsten av parasiter under patentperioden på slumpmässiga platser på fekal suspensionsyta.
5. Tolkning av flotationsmetoden
OBS: Negativa resultat är ofullständiga.
- Utför en serie av tre tester med samples från 3 på varandra följande dagar för att öka testets känslighet.
OBS: Positiva resultat indikerar förekomst av parasiter under patentperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta arbete beskrivs insamling och koproparasitoskopiska procedurer för identifiering av T. canis och Ancylostoma spp. Logiken bakom anpassningen av den enkla fekala flotationsmetoden för att upptäcka hundens maskägg är att denna teknik är kostnadseffektiv eftersom lösningarna, utrustningen och materialen är billiga. Därför har metoden en hög provhanteringskapacitet eftersom flera prover kan bearbetas på kort tid. Dessutom är den enkla fekala flotationsmetoden lätt att utföra och relativt känslig.
Urvalsstorleken och valet av djur gjordes efter bekvämlighet som i huvudsak bestämdes av djurägarens vilja och säkerheten hos förvildade hundar som närmade sig. I detta arbete användes flotationsmetoden för att bedöma förekomst och frekvens av Ancylostoma spp. och T. canis hos hundar Canis lupus familiaris i Mexiko under 4 år med start 2017. Avföringsprover från 1 638 hundar samlades in och screenades mikroskopiskt. Totalt var 1 235 hundar positiva för T. canis och Ancylostoma spp. Ett av målen med att använda flotationsmetoden var att visa dess effektivitet när det gäller att mäta förekomsten av Toxocara eller Ancylostoma, men vi ville också göra en djupare undersökning av de faktorer som kan påverka deras prevalens. Följaktligen kasserades 185 djur med blandinfektioner. Antalet positiva prover för Ancylostoma spp. var 833 (78,95 % frekvens) och 222 (21,04 %) för T. canis. Av de 1 050 proverna bearbetades och lästes 75,5 % (793 prover) i fältmiljö genom att flotationslösningen bereddes med en läskflaska och ett mikroskop med 3 x 1,2 V AA-batterier för 4 timmars kontinuerlig drift. De återstående 257 avföringsproverna undersöktes i laboratoriet.
Ett mål med denna studie var att använda en flotationslösning och en metod i fältmiljö för att påskynda och underlätta diagnosen av två maskparasiter hos hundar i områden där ingen laboratorieinfrastruktur eller utrustning finns tillgänglig. Fälttillämpningen av flotationsmetoden gjorde det möjligt för oss att kommunicera resultaten till 400 ägare omedelbart efter varje mikroskopisk avläsning för att ge rekommendationer om avmaskningsmedel och förebyggande åtgärder och därmed undvika parasitspridning hos människor eller sällskapsdjur. På samma sätt gjorde flyttekniken i fältmiljö det möjligt att undersöka förvildade hundar och ge dem en avmaskningsbehandling med godis eller mat. Figur 3A och figur 3B visar ägg av T. canis respektive Ancylostoma spp. som observerats efter det att flotationslösningen och flotationstekniken utförts i fält. När färska avföringsprover utsattes för flotationsmetoden i fältmiljö kunde lösningen som beretts i en läskflaska föra in helmintägg i flotation. Produktionen av saltkristaller och luftbubblor jämfördes med proverna som lästes i laboratoriemiljö och ingen skillnad upptäcktes av operatören. Denna observation är uppmuntrande och utmanar kunskapen om att koncentrationen av fekala prover garanterar en mer exakt mikroskopisk avläsning.
När flotationslösningen och avföringsproverna bearbetades i laboratoriemiljö sågs ingen skillnad i morfologi och tydlighet i avläsningarna under mikroskopet eftersom samma mängd skräp flöt samtidigt i både fält- och laboratoriekopromikroskopisk detektion av parasiter. Figur 3A,B visar T. canis respektive Ancylostoma spp. ägg som återfanns från de 257 prover som bearbetades i en fullt utrustad laboratoriemiljö efter transport av prover från stads-, förorts- och landsbygdsområden. Dessa parasitägg skilde sig inte morfologiskt från de som observerats under fältförhållanden (Figur 3C).
Detta protokoll genererade ett tillräckligt antal fynd för att bedöma inverkan av plats, årstid, kön, ras, ålder och utomhus- eller inomhusförhållanden i T. canis och Ancylostoma spp. prevalens. Prevalensdata jämfördes med ANOVA-testet med ett signifikansvärde på 0,05. Tabell 2 visar att T. canis uppvisade en signifikant högre utbredningsfrekvens i tempererade och torra klimat jämfört med stater som kännetecknas av varma klimat, medan det inte fanns någon anmärkningsvärd variation i prevalensen av Ancylostoma spp. mellan regioner med dominerande varma, tempererade eller torra klimat. På samma sätt påträffas Ancylostoma spp. och T. canis oftast på sommaren. Det visade sig att 60,86 % av männen var positiva för ancylostomiasis och 37,38 % för toxocariasis. Dessutom upptäcktes T. canis oftare hos valpar yngre än 6 månader. medan Ancylostoma spp. diagnostiserades mer hos vuxna hundar. Intressant nog hittades ingen skillnad mellan hundraser. Hundhakmasken infekterade 65,54 % av utomhushundarna; ändå upptäcktes T. canis lika mycket hos hundar med utomhus- eller inomhusstatus.
Figur 1: Avföringsprovsamling från hundar. A) Försiktighet måste iakttas vid insamling av avföringsprover från viltlevande hundar. När så är möjligt ska färsk avföring samlas in och förvaras i en plastpåse för inlämning och koproparasitoskopisk analys i laboratoriet. Proverna ska kylas vid 4 °C och placeras i frigolitlådor eller isolerade metallhöljen inom 24 timmar efter insamlingen. B) Tre gram avföring rekommenderas som standard. Därför är 2-5 g rimligt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Beredning av en mättad saltlösning och bearbetning av fekal suspension för mikroskopi. (A) Den ideala densiteten för en mättad lösning gjord med salt bör vara över 1,20. Det rekommenderas starkt att kontrollera att det inte finns några kristaller i botten och att lösningen är genomskinlig. (B) Genom att låta fekal suspension passera genom en plastsil avlägsnas grova partiklar. C) Inokuleringsslingan måste utsättas för en låga (en laboratoriebrännare eller en vanlig bärbar tändare) för att säkerställa att den är fri från kontaminering. (D) Låt inokuleringsslingan svalna och ta tre droppar från olika ställen på suspensionens yta. (E) Efter att ha placerat den första droppen på glasglaset, undvik att flytta glaset för att minska spillet av droppen. Glasglaset ger en tunn och transparent plattform som möjliggör observation av prover. (F) Placera den andra droppen i mitten av glasglaset. Att ta en andra droppe från ytan av den fekala suspensionen ökar sannolikheten för att hitta ägg i en suspension där parasitstrukturer kan ha varit ojämnt fördelade. (G) Placera den tredje droppen på glasskivan. En tredje droppe från ytan av avföringssuspensionen gör det möjligt att observera ett annat område där flytande ägg kan ha koncentrerats. H) De tre dropparna observeras separat på glasglaset för att påvisa nematodägg från olika delar av fekal suspensionens yta. (I) Observera sample under ett mikroskop med 10x-objektivet. Om objektivet ändras till 40x, placera ett täckglas på de fekala suspensionsdropparna. När ett positivt resultat observeras i droppen, tilldela ett kryss (+) för att markera närvaron av parasiter under patentperioden på slumpmässiga platser på fekal suspensionsyta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ägg av Toxocara canis och Ancylostoma spp. påvisade med ljusmikroskopi med 40x förstoring. A) Ägg av Toxocara canis påvisas med ljusmikroskopi med 40x förstoring. Flotationsmetoden gjorde det möjligt att visualisera rena mikroskopiska fält fria från grovt material (samlade i fältmiljö). Oavsett beredningsmetod för flotationslösningen var äggen synliga och observerades huvudsakligen utan morfologiska förändringar. B) Ägg av Ancylostoma spp. påvisade med ljusmikroskopi med 40x förstoring. Även om ingen koncentration av avföring utfördes (i fältmiljö) åtgärdades med den enkla flotationsmetoden bristerna i morfologisk detektion av ägg i avföring när proceduren gjordes enligt den nuvarande metoden. C) Ägg av T. canis och Ancylostoma spp. påvisade med ljusmikroskopi med 40x förstoring. Morfologiska egenskaper hos dessa ägg (som återfanns i laboratoriemiljö) var tydliga även om ingen koncentration av avföringsprover gjordes och inte skilde sig från de ägg som återfanns i fältmiljö. Skalstaplar = 75 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Ancylostoma spp. | Toxocara canis | ||
| Klimat | Varmt klimat | 38,66En | 22.52A |
| Torrt klimat | 29.41A | 36,03En | |
| Tempererat klimat | 31,93A | 41,44b | |
| Vår | 23,76En | 19,81En | |
| Sommar | 49,81b | 50,00b | |
| Höst | 17.52A | 20.27a | |
| Vinter | 8,88c | 9.90c | |
| Genus | Manlig | 60,86en | 62,61A |
| Kvinnlig | 39.13b | 37,38b | |
| Ålder | 0-3 månader | 18,72A | 51,80en |
| 3-6 månader | 15,48a | 32,43b | |
| > 6 månader | 22.44En | 10.36c | |
| > 1 år | 43.33b | 5,40hp | |
| Ras | Korsning | 52,78a | 55,86en |
| Renrasig | 47.22A | 44.14A | |
| Bostadsstatus | Inomhus | 34,45a | 52,25a |
| Utomhus | 65,54A | 47,74b |
Tabell 2: Prevalens (%) av Ancylostoma spp. och Toxocara canis hos hundar i Mexiko under 4 år beroende på klimat, säsong, kön, ålder, ras och inhysningsstatus. Indikationer från data visar att det inte finns någon signifikant variation i prevalensen av Ancylostoma spp. mellan områden som kännetecknas av varmt, tempererat eller torrt klimat. Däremot uppvisar T. canis en betydligt högre prevalens i tempererade och torra klimat jämfört med varma klimat. Dessutom är både Ancylostoma spp. och T. canis vanligast förekommande under sommarsäsongen. Analys av data visar vidare att 60,86 % av hanhundarna testade positivt för ancylostomiasis, medan 37,38 % testade positivt för toxocariasis. Dessutom är T. canis vanligare hos valpar som är yngre än 6 månader, medan Ancylostoma spp. är vanligare hos vuxna hundar. Intressant nog observerades inga märkbara skillnader mellan olika hundraser. Resultaten visar att 65,54 % av utomhushundarna är infekterade med hundhakmask, medan T. canis är lika utbredd bland inomhus- och utomhushundar. *Medelvärden inom en kolumn av faktorn (klimat, säsong, kön, ålder, ras och boende) följt av samma bokstäver skiljer sig inte signifikant vid P < 0,05 enligt ANOVA-testet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nematoder som T. canis och Ancylostoma spp. kan leva i tunntarmen hos hundar och har potential att överföras till människor. Kliniska tecken orsakade av T. canis är allvarliga hos unga hundar och yttrar sig som dålig tillväxt, andningsproblem eller skador på matsmältningskanalen. Hos vuxna hundar tenderar infektionen vanligtvis att vara mild. Diagnosen bygger på att identifiera karakteristiska ägg i ett avföringsprov. Detta tillstånd är en vanlig orsak till att förskriva avmaskningsmedel till hundar29. För att förstå Toxocaras epidemiologi är det viktigt att inse att parasiten kan överföras från mamman till valpen både genom moderkakan före födseln och genom digivning som en galaktogen infektion strax efter valpningen. Människor kan smittas av T. canis när de får i sig smittsamma ägg, vilket kan ske på olika sätt, t.ex. genom förorenad jord eller päls på en infekterad hund. I det här fallet fungerar människor som parateniska värdar, och även om det inte finns någon parasitisk reproduktion kan de frigjorda larverna från äggen potentiellt orsaka skada, särskilt när det gäller barn30.
Infektion med hakmasken Ancylostoma spp. hos hundar uppstår när djuren får i sig larverna eller när larverna tränger in i huden. Valpar kan smittas av infektionen genom att äta en paratenisk värd eller genom den laktogena vägen31. Mogna hakmaskar livnär sig på blod, vilket kan leda till allvarlig anemi och gastrointestinala symtom, särskilt hos unga hundar. Infektioner som uppstår genom huden resulterar i dermatit, som vanligtvis försvinner ungefär en vecka efter att infektionen börjat. Olika anthelmintiska läkemedel har använts, åtföljda av stödjande terapi. Det har dock förekommit rapporter om resistens mot avmaskningsmedel. Ancylostom har potential att vara patogen för människor. Transkutan överföring av L3-larver kan leda till ett tillstånd som kallas kutana larva migrans. Dessa lesioner försvinner i allmänhet utan behandling under några månader. I sällsynta fall kan hundens hakmaskar migrera in i människans mag-tarmkanal och inducera eosinofil enterit30.
En exakt, ekonomisk och snabb diagnos av parasitos hos hundar är avgörande för att öka vår epidemiologiska kunskap om helminthiaser hos hundar. Av denna anledning anpassade vi ett protokoll för den enkla flotationstekniken som ska användas i fältmiljö för att detektera T. canis och Ancylostoma spp. En relevant fråga i det nuvarande protokollet var insamlingen av prover från förvildade hundar, eftersom dessa djur vanligtvis är svåra att hantera. Därför gjordes provtagningen genom att observera och följa hundarna tills de bajsade, vilket gjorde provtagningsmetoden tidskrävande, utmanande och på något sätt farlig. Enligt vår erfarenhet rekommenderar vi starkt att man utvärderar parasitologiska studier på skyddshundar.
När det gäller den zoonotiska tillvaratagningen av maskägg fortsätter kvalitativ koprosskopi att vara den metod som vanligen används i parasitologilaboratoriet för diagnostiskaändamål. Tidigare studier har visat att flotationstekniken med en mättad saltlösning är mer tillförlitlig än direkt mikroskopi. Till exempel bestämde Dryden och medarbetare en sensitivitet på 95,15 % för Ancylostoma spp. ägg i 206 fekala prover som bearbetats med flotationstekniken och 27,18 % med direkt mikroskopi32. Det är accepterat att flotationslösningens densitet är en kritisk faktor för flotationsmetoden 14,20,23. I lösningar som inte når den densiteten tar det längre tid för de parasitiska formerna att flyta eller aldrig flyta. När en flotationslösning är övermättad kristalliseras den på ett par minuter och ännu tidigare om en täckglas placeras20.
Valet av flotationslösning i detta protokoll baserades på enkel förberedelse, bekvämlighet, kostnad och miljöpåverkan. Även om sockerlösningen tar längre tid att kristallisera, bör formalin eller fenol tillsättas som konserveringsmedel och minska den klibbiga eller klibbiga känslan; vilket är en olägenhet under de fältförhållanden som rådde i denna studie. Dessutom är bortskaffande av kemiska reagenser en komplex fråga på grund av miljöbestämmelser. Data i denna studie visade att den mättade lösningen framställd med vanligt bordssalt under fältförhållanden med hjälp av en läskflaska på grund av bristen på laboratorieutrustning för att bereda och koka en flotationslösning, var lika effektiv som den som bereddes i laboratoriemiljö. Den enda märkbara skillnaden är den längre tid det tar att skaka läskflaskan tills en genomskinlig lösning kan ses. Mikroskopiska observationer var lika rena för provet som preparerats med båda metoderna för att bereda den mättade lösningen. Det är viktigt att utföra fler studier i framtiden med ett större antal prover för att bekräfta ovannämnda påstående. Ändå är det tidskrävande och kräver den fysiska ansträngningen att skaka lösningen inuti flaskan i timmar. Ett annat kritiskt steg i protokollet består av att låta fekal suspension stå i minst 15 minuter så att äggen kan flyta och koncentreras på ytan. Men ju längre vilotid, desto mer skräp kommer att flyta och efter några timmar kommer äggen att deformeras eller gå sönder. Med tanke på att känsligheten och specificiteten hos koproparasitoskopiska metoder är låg och att noggrannheten hos dessa metoder som diagnostiska tester beror på användarens färdigheter, utförde utbildade och erfarna parasitologer i den aktuella studien flotationstekniken och identifierade parasiterna.
Denna studie är, så vitt vi vet, den första som uppskattar prevalensen av Ancylostoma spp. och T. canis hos hundar i Mexiko med hjälp av avföringsprover som undersökts med den enkla flytmetoden i fältmiljö. Det visades här att den flytteknik vi använde, trots att den har använts i årtionden, fortfarande är ett mycket effektivt, ekonomiskt och snabbt diagnostiskt test14. Trots detta finns det koproparasitoskopiska tekniker med högre känslighet och specificitet än den vi använde för diagnos av hundmaskar; såsom sedimentationskoncentrationen, vilket är fallet med Faust-tekniken. Dessutom är det viktigt att notera att Faust, som är en koncentrationsmetod, också har visat sig vara mer effektiv vid detektion av protozoer som Giardia33. Den koproparasitoskopiska metod vi valde för denna studie hade dock flera fördelar såsom kostnad. Faust-tekniken är dyrare än flotation med saltlösningsmättad lösning eftersom den kräver ytterligare och dyr utrustning som en centrifug. Andra koncentrationsmetoder, t.ex. de som använder reagenser som zinksulfat, är dyrare än vanligt salt och behöver mer tid på grund av antalet nödvändiga tvättar i centrifugen. Därför är Faust-tekniken begränsad för dess användning i fältarbete där det inte är vanligt att ha tillgång till en centrifug.
Viktigast av allt är att en begränsning med den enkla flyttekniken är att den inte är tillräckligt känslig för att upptäcka Cryptosporidium-oocystor , Giardia-cystor eller Trichuris-ägg . Centrifugeringsmetoder för att koncentrera parasitformer bör därför användas om diagnosen av dessa arter är avsedd. Det är viktigt att betona att positivitetsgraden för de släkten som rapporterats i denna studie inte bör betraktas som avgörande eftersom en bekvämlighetsmetod användes som urvalsstrategi. Det är viktigt att notera att det kan finnas situationer, till exempel i djurhem med utmanande djurhantering, där det blir avgörande att identifiera maskparasiter hos hundar. Som ett resultat av detta kan detta protokoll behöva justeras i framtiden för att tillgodose insamlingen av kombinerade prover.
Som en svag punkt bör det noteras att den enkla flotationsmetoden och beredningen av den mättade lösningen av NaCl utvecklades för ett specifikt syfte - att undersöka hundavföring under mestadels fältförhållanden - men känsligheten för den enkla flytproceduren har i allmänhet ansetts vara låg. För att upptäcka cystor eller ägg av tyngre parasitarter rekommenderas därför starkt användning av en koncentrationsteknik. Med tanke på den låga känsligheten hos den enkla flotationsmetoden, oavsett om den utförs i fält eller laboratorium, var det rimligt att tvivla på om denna teknik skulle vara användbar som en metod för epidemiologiska studier av maskparasiter hos hundar. Icke desto mindre indikerar den höga prevalensen av Ancylostoma spp. hos hundar i denna studie och upptäckten av T. canis-ägg att den enkla flotationsmetoden, oavsett om den utförs i fält- eller laboratoriemiljö, är användbar för att ge bevis som kan stödja ytterligare epidemiologiska studier och föreslå kontroll- och förebyggande åtgärder för att minska infektionen av hundar och människor med dessa nematoder.
Med hjälp av den enkla flytmetoden analyserade vi de faktorer som påverkar T. canis och Ancylostoma spp. äggens återhämtning från hundavföring. Fynden av T. canis stämde överens med den senaste forskningen som tyder på att parasiter är betydligt vanligare i tempererade och tropiska områden. Detta är i linje med tidigare studier som har undersökt hur miljöfaktorer, särskilt temperatur och nederbörd, påverkar parasitarternas ekologiska utbredning 34,35,36. De aktuella resultaten visade att båda maskarna infekterar hanar i en signifikant högre andel. Det är rimligt att spekulera i att detta fynd berodde på att män är immunologiskt mindre reaktiva mot infektioner 37,38. Ålder påverkar förekomsten av T. canis eftersom valpar påverkades mer av denna parasit. Detta fynd stämmer överens med tidigare forskning som tyder på att denna parasit tenderar att påverka valpar i större utsträckning, medan vuxna individer utvecklar ökad resistens, vilket resulterar i en lägre sannolikhet för infektion 6,39. Både korsningshundar och renrasiga hundar uppvisade jämförbara prevalenser av Toxocara canis och Ancylostoma spp. Förvildade hundar uppvisade dock en högre prevalens av Ancylostoma spp. jämfört med hundar som levde i hemmiljöer. Detta resultat stämmer inte överens med tidigare rapporter som inte upptäckte skillnader mellan hundraser6. Slutsatsen kan vara att framtida tillämpningar av beredningen av den mättade saltlösningen och den enkla flotationsmetod som används i detta protokoll kan utföras för rutinmässiga fekala undersökningar under fält- eller laboratorieförhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma mot Dirección General de Asuntos del Personal Académico vid Universidad Nacional Autónoma de México för att ha tillhandahållit de finansiella resurserna genom anslaget PAPIIT IN218720 och till Dr. Claudia Mendoza för att ha beviljat den begärda förlängningen. Detta verk är tillägnat min underbara Nicole, som gick bort 2019. Du kommer alltid att leva i mitt hjärta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
References
- Duncan, K. T., Koons, N. R., Litherland, M. A., Little, S. E., Nagamori, Y. Prevalence of intestinal parasites in fecal samples and estimation of parasite contamination from dog parks in central Oklahoma. Veterinary Parasitology Regional Studies and Reports. 19, 100362 (2020).
- Kisiel, L. M., et al. Owned dog ecology and demography in Villa de Tezontepec, Hidalgo, Mexico. Preventive Veterinary Medicine. 135, 37-46 (2016).
- Lyons, M. A., Malhotra, R., Thompson, C. W. Investigating the free-roaming dog population and gastrointestinal parasite diversity in Tulúm, México. PLoS One. 17 (10), e0276880 (2022).
- Dantas-Torres, F., et al. TROCCAP recommendations for the diagnosis, prevention and treatment of parasitic infections in dogs and cats in the tropics. Veterinary Parasitology. 283, (2020).
- Cantó, G. J., García, M. P., García, A., Guerrero, M. J., Mosqueda, J. The prevalence and abundance of helminth parasites in stray dogs from the city of Querétaro in central Mexico. Journal Of Helminthology. 85 (3), 263-269 (2011).
- Torres-Chablé, O. M., et al. Prevalence of gastrointestinal parasites in domestic dogs in Tabasco, Southeastern Mexico. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 24 (4), 432-437 (2015).
- Cortez-Aguirre, G. R., Jiménez-Coello, M., Gutiérrez-Blanco, E., Ortega-Pacheco, A. Stray dog population in a city of Southern Mexico and its impact on the contamination of public areas. Veterinary Medicine International. 2018, 1-6 (2018).
- Rodríguez-Vivas, R. I., et al. An epidemiological study of intestinal parasites of dogs from Yucatán, Mexico, and their risk to public health. Vector Borne Zoonotic Diseases. 11 (8), 1141-1144 (2011).
- Maggi, R. G., Krämer, F. A review on the occurrence of companion vector-borne diseases in pet animals in Latin America. Parasites & Vectors. 12 (1), 145 (2019).
- Cruz-Vazquez, C., Castro, G., Parada, F., Ramos, P. Seasonal occurrence of Ctenocephalides felis and Ctenocephalides canis (siphonaptera:Pulicidae) infesting dogs and cats in an urban area in Cuernavaca, Mexico. Entomological Society of America. 38 (1), 111-113 (2001).
- Bolio-Gonzalez, M. E., et al. Prevalence of the Dirofilaria immitis infection in dogs from Mérida, Yucatán, Mexico. Veterinary Parasitology. 148 (2), 166-169 (2007).
- Pastor-Santiago, J. A., Flisser, A., Chávez-López, S., Guzmán-Bracho, C., Olivo-Díaz, A. American visceral leishmaniasis in Chiapas, Mexico. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86 (1), 108-114 (2012).
- Trasviña-Muñoz, E., et al. Detection of intestinal parasites in stray dogs from a farming and cattle region of Northwestern Wexico. Pathogens. 9 (7), (2020).
- Ballweber, L. R., Beugnet, F., Marchiondo, A. A., Payne, P. A. American Association of Veterinary Parasitologists' review of veterinary fecal flotation methods and factors influencing their accuracy and use--is there really one best technique. Veterinary Parasitology. 204 (1-2), 73-80 (2014).
- Nielsen, M. K. What makes a good fecal egg count technique. Veterinary Parasitology. 296, 109509 (2021).
- Gordon, H. M., Whitlock, H. V. A new technique for counting nematode eggs in sheep faeces. Journal of the Council for Scientific and Industrial Research. 12 (1), 50-52 (1939).
- O'grady, M. R., Slocombe, J. O. D. An investigation of variables in a fecal flotation technique. Canadian Journal of Comparative Medicine. 44 (2), 148 (1980).
- ESCCAP. Worm control in dogs and cats. Guideline 01. European Scientific Counsel Companion Animal Parasites. , (2017).
- Cringoli, G., et al. Ancylostoma caninum: Calibration and comparison of diagnostic accuracy of flotation in tube, McMaster and FLOTAC in faecal samples of dogs. Experimental Parasitology. 128 (1), 32-37 (2011).
- Figueroa, C. J. A. Examen coproparasitoscópico. In: Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria, Consejo Técnico Consultivo Nacional de Sanidad Animal. AMPAVE-CONASA. , 83-105 (2015).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Adolph, C., et al. Diagnostic strategies to reveal covert infections with intestinal helminths in dogs. Veterinary Parasitology. 247, 108-112 (2017).
- Cringoli, G., Rinaldi, L., Maurelli, M. P., Utzinger, J. FLOTAC: New multivalent techniques for qualitative and quantitative copromicroscopic diagnosis of parasites in animals and humans. Nature Protocols. 5 (3), 503-515 (2010).
- Katagiri, S., Oliveira-Sequeira, T. C. Comparison of three concentration methods for the recovery of canine intestinal parasites from stool samples. Experimental Parasitology. 126 (2), 214-216 (2010).
- Rehbein, S., Lindner, T., Visser, M., Winter, R. Evaluation of a double centrifugation technique for the detection of Anoplocephala eggs in horse faeces. Journal of Helminthology. 85 (4), 409-414 (2011).
- Liccioli, S., et al. Sensitivity of double centrifugation sugar fecal flotation for detecting intestinal helminths in coyotes (Canis latrans). Journal of Wildlife Diseases. 48 (3), 717-723 (2012).
- Rishniw, M., Liotta, J., Bellosa, M., Bowman, D., Simpson, K. W. Comparison of 4 Giardia diagnostic tests in diagnosis of naturally acquired canine chronic subclinical giardiasis. Journal of Veterinary Internal Medicine. 24 (2), 293-297 (2010).
- Barutzki, D., Schaper, R. Endoparasites in dogs and cats in Germany 1999-2002. Parasitology Research. 90, S148-S150 (2003).
- Carlin, E. P., Tyungu, D. L. Toxocara: Protecting pets and improving the lives of people. Advances in Parasitology. 109, 3-16 (2020).
- Saari, S., NaReaho, A., Nikander, S. Canine parasites and parasitic diseases. , Academic Press. (2019).
- Bowman, D. D., Montgomery, S. P., Zajac, A. M., Eberhard, M. L., Kazacos, K. R. Hookworms of dogs and cats as agents of cutaneous larva migrans. Trends in Parasitology. 26 (4), 162-167 (2010).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Barutzki, D., Schaper, R. Results of parasitological examinations of faecal samples from cats and dogs in Germany between 2003 and 2010. Parasitology Research. 109, S45-S60 (2011).
- Novobilský, A., Novák, J., Björkman, C., Höglund, J. Impact of meteorological and environmental factors on the spatial distribution of Fasciola hepatica in beef cattle herds in Sweden. BMC Veterinary Research. 11, 128 (2015).
- Pickles, R. S., Thornton, D., Feldman, R., Marques, A., Murray, D. L. Predicting shifts in parasite distribution with climate change: A multitrophic level approach. Global Change Biology. 19 (9), 2645-2654 (2013).
- Pérez-Rodríguez, A., De La Hera, I., Fernández-González, S., Pérez-Tris, J. Global warming will reshuffle the areas of high prevalence and richness of three genera of avian blood parasites. Global Chaneg Biology. 20 (8), 2406-2416 (2014).
- Nava-Castro, K., Hernández-Bello, R., Muñiz-Hernández, S., Camacho-Arroyo, I., Morales-Montor, J. Sex steroids, immune system, and parasitic infections: Facts and hypotheses. Annals Of The New York Academy Of Sciences. 1262, 16-26 (2012).
- Morales-Montor, J., Escobedo, G., Vargas-Villavicencio, J. A., Larralde, C. The neuroimmunoendocrine network in the complex host-parasite relationship during murine cysticercosis. Current Topics in Medicinal Chemistry. 8 (5), 400-407 (2008).
- Olave-Leyva, J., et al. Prevalencia de helmintos gastrointestinales en perros procedentes del servicio de salud de Tulancingo, Hidalgo. Abanico Veterinario. 9 (1), 1-10 (2019).
