Summary
Bu çalışma, tarla koşullarında 2017'den 2021'e kadar Meksika'daki köpeklerden toplanan dışkı örneklerinde tespit edilen Toxocara canis ve Ancylostoma spp.'yi tanımlamak için bir yüzdürme yönteminin kullanımını açıklamaktadır.
Abstract
Toxocara canis ve Ancylostoma caninum gibi zoonotik potansiyele sahip köpek parazitlerinin tarla koşullarında teşhisi, Meksika'daki kırsal ve banliyö alanlarında bir laboratuvara sınırlı erişim nedeniyle genellikle zordur. Bu çalışmada 2017-2021 yılları arasında Meksika'daki köpeklerden alınan dışkı örneklerinde tarla koşullarında T. canis ve Ancylostoma spp.'nin saptanması amaçlanmıştır. Örneklem büyüklüğü hesaplaması, ülke genelinde 534 köpeğin hedef kaydıyla sonuçlandı.
Örnekler dışkılama sonrası doğrudan rektumdan veya yerden toplandı. Numuneler ayrı, sıkıca kapatılmış plastik torbalarda 4 °C'de saklandı. Hem saha hem de laboratuvar koşullarında doymuş bir sodyum klorür çözeltisi (özgül ağırlık [SpG] 1.20) hazırlandı. Toplandıktan sonraki 3 gün içinde, her bir dışkı örneğini bir tuzlu su çözeltisinde süspanse ederek yüzdürme yöntemi kullanılarak 2-4 g dışkı parazitler açısından test edildi. Dışkı yüzdürme çözeltisi ile karıştırıldı ve metal bir kaşık kullanılarak ezildi.
Düzgün bir kıvam elde edildikten sonra, dışkı örneği bir elek kullanılarak yeni bir plastik kaba döküldü ve 10-15 dakika bekletildi. Karışımın üstünden üç damla, sterilize edilmiş bir aşılama halkası kullanılarak toplandı. Slaytlar mikroskoba yerleştirildi ve parazitler eğitimli parazitologlar tarafından tanımlandı. 1.055 köpekten alınan dışkı örnekleri mikroskobik olarak tarandı. Ancylostoma spp. için pozitif örnek sayısı 833 (%78.95) ve T. canis için 222 (%21.04) idi. Bu bulgular, Meksika'da kentsel ve kırsal alanlarda yaşayan köpeklerde zoonotik helmintlerin laboratuvarda ve tarla koşullarında koproparasitoskopik bir teknik kullanılarak tanımlanmasının önemini göstermektedir.
Introduction
Gastrointestinal parazitler, köpekleri etkileyen en yaygın sağlık sorunlarından biridir1. Tahminler, dünya çapında ~ 700 milyon evcil köpek olduğunu ve yaklaşık 175 milyonunun serbest dolaşım2 olarak kategorize edilebileceğini göstermektedir. Köpekler ve insanlar arasında 60'tan fazla parazit türü paylaşılmaktadır, bu da köpeklerin bu parazitlerle insanlar için bir enfeksiyon kaynağı olabileceğini düşündürmektedir3. Toxocara canis ve Ancylostoma caninum, köpekleri ve yanlışlıkla insan konakçıları enfekte eden iki parazitik türdür. Şu anda, bu helmintlerin Meksika'da hayatta kalabildikleri ve üreyebildikleri yerler hakkında birkaç çalışma var. Köpeklerde Toxocara prevalansı Amerika Birleşik Devletleri, Meksika, Orta Amerika ve Karayipler'de %0 ile %87 arasında değişmektedir4. Toxocara canis ve Ancylostoma spp., köpeklerde diğer parazitik türlerin yanı sıra, daha önce Meksika'da 5,6,7,8,9,10,11,12,13 bildirilmiştir (Tablo 1).
| Parazit türler | Bölge | Yaygınlık (%) | Referans |
| Ancylostoma caninum | Querétaro | 42.90 | 5 |
| Tabasco | 15.90 | 6 | |
| Campeche | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| Yucatán | 73.8 | 8 | |
| Babesia Belediyesi | Morelos | 13.60 | 9 |
| Veracruz | 10.00 | ||
| Koksidiyal ookistler | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Ktenosefalitler | Morelos | 30.3 | 10 |
| Dipylidium caninum | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Dirofilaria (Dirofilaria Bölgesi) | Yucatán | 7.0 – 8.3 | 11 |
| Fransa | Tabasco | 3.00 | 6 |
| Yucatán | 18.8 | 8 | |
| Leishmania (Leishmania) | Chiapas | 19.00 | 12 |
| Tenyalar | Baja Kaliforniya | 6.79 | 13 |
| Toxocara canis | Querétaro | 22.10 | 5 |
| Yucatán | 6.20 | 8 | |
| Trichuris vulpis (Trichuris vulpis) | Yucatán | 25.40 | 8 |
| Tripanosoma (Tripanozoma) | Jalisco | 8.10 | 9 |
| Campeche | 7.60 | ||
| Chiapas | 4.5 – 42.8 | ||
| Quintana Roo | 20.1 – 21.3 | ||
| Toluca | 17.50 | ||
| Yucatán | 9.8 – 34 |
Tablo 1: 2001'den 2020'ye kadar Meksika'da köpek parazitlerinin bölgesel yaygınlığı (%) 2001'den 2020'ye kadar yürütülen önceki araştırmalardan elde edilen bulgular, Meksika'daki çeşitli kentsel ve kırsal ortamlarda köpek parazit dağılımının belirlenmesini sağlamıştır. Bu çalışmalar, farklı ekosistemlerde köpek parazitlerinin kalıcılığına yardımcı olan epidemiyolojik unsurların derinlemesine anlaşılmasını sağlayarak, bazı parazit türlerinin zoonotik etkisinin kapsamlı bir değerlendirmesine katkıda bulunur.
Yumurtalar, kistler, ookistler veya larvalar gibi bağırsak parazitlerinin yaşam döngüsü aşamaları dışkı örneklerinde bulunabilir. Bu nedenle, dışkı materyalinin incelenmesi, bir hayvanın parazitleri hakkında değerli bilgiler sağlar. İnsan dışkısında Ancylostomidae yumurtalarını tespit etmek için bir yönteme duyulan ihtiyaç, 1878'de gastrointestinal parazitleri tespit etmek için uzun yıllar kullanılan ancak çok hassas olmadığı düşünülen basit dışkı yaymasının kullanılmasına yol açtı. Bu nedenle, daha iyi kopromikroskobik yöntemler geliştirme ihtiyacı ortaya çıkmıştır14. Dışkı örneklerinde parazit yumurtalarının geri kazanılması ve sayılması için yüzdürme tekniğinin ilk kez tanımlanmasından bu yana100 yıldan fazla zaman geçmiştir 15. O zamandan beri, yüzdürme tekniğinin çeşitli yöntemleri ve varyantları, konakçılarında bazı parazitlerin tespiti için bir standart olarak kabul edilmiştir.
Örneğin, Lane, 1924'te, santrifüjlemeyi ve ardından tortuyu 1 g (Lane) veya 10 g (Stoll'un modifikasyonu) SpG 1.2 ile doymuş bir sodyum klorür çözeltisi içinde yüzdürmeyi entegre eden doğrudan santrifüjlü yüzdürme tekniğini içeren bir yöntem tanımladı. Yüzdürme tekniği daha sonra farklı SpG14'e sahip çözeltiler kullanılarak değiştirildi. 1939'da Gordon ve Whitlock, parazit yumurtalarının görselleştirilmesinde döküntülerin müdahalesi nedeniyle Stoll'un tekniğinin dezavantajlarını bildirdiler ve McMaster16 olarak bilinen kantitatif yöntemi geliştirdiler. 1979'da O'Grady ve Slocombe, çözeltinin özgül ağırlığının, zamanlamasının ve süzgeçlerin ağ boyutlarının, yüzdürme tekniğini kullanarak yumurta tespitinin doğruluğunu etkilediğinigösterdi 17. Son yıllarda, yüzdürme tekniğinde çeşitli değişiklikler yapıldığından, yüzdürme yöntemlerinin standardizasyonuna acil bir ihtiyaç vardır. Şu anda, zoonotik nematodların enfeksiyöz aşamaları ile çevresel kontaminasyonu sınırlamak için uygun antelmintik tedavilerin uygulanması için zoonotik parazitlerin önlenmesi bağlamında köpek helmint enfeksiyonlarının saptanması gerekmektedir18.
Kalitatif yöntemler arasında fekal flotasyon tekniği, fazla ekipman gerektirmediği, basit, ucuz ve tekrarlanabilir olduğu için yaygın olarak kullanılmakta ve kabul edilmektedir; Yine de, enfeksiyonun yoğunluğu düşük olduğunda duyarlılıktan yoksun olması nedeniyle büyük bir dezavantajı vardır19. Yumurtalar, ookistler, kistler veya nematod larvaları gibi daha fazla sayıda parazitik elementin varlığını ortaya çıkarma yeteneği genellikle çözeltininyoğunluğu ile belirlenir 20.
Önceki raporlar, köpek nematod yumurtalarının tespiti için koproparazitolojik teknikleri karşılaştırmıştır. Hareketli protozoaların tespiti ile ilgili olarak, doğrudan dışkı yaymaları kullanılır; Sedimantasyon yöntemleri ise trematodlar gibi parazitlerin ağır yumurtalarını teşhis etmek için yararlıdır21. En yaygın kullanılan alan bazlı tanı testlerinden biri fekal smear yöntemidir. Bununla birlikte, bu tekniğin düşük hassasiyet seviyesi, parazit yumurtalarının tespitine müdahale eden döküntüler içermesine bağlanabilir. Uygun SpG'yi sağlayan çözümlerle birlikte bir eleme adımını dahil ederek, yüzdürme yöntemi, ascarid ve kancalı kurt yumurtalarının daha net ve daha az karmaşık bir gözlemini sunar. Bu, mikroskobik tarama için daha hassas ve verimli bir sürece yol açar22. Benzer şekilde, parazit yumurtalarını ve ookistlerini geri kazanmak için basit yüzdürme ve doğrudan santrifüj yüzdürme teknikleri çok yaygın olarak kullanılmaktadır14. Klasik yüzdürme yöntemleri, McMaster yöntemi15 gibi bir sayma odasının kullanımına bağlı olarak kalitatif veya kantitatif olarak kabul edilebilir. Bununla birlikte, yüzdürme tekniğinin duyarlılığı düşük olduğundan ve patent döneminde parazitlerin tespitine odaklandığından, olumsuz sonuçlar kesin olarak kabul edilmemelidir. Bununla birlikte, doğruluk sadece dışkı örneklerinin koruma prosedürüne veya yüzdürme çözeltilerinin SpG'sine bağlı değildir, aynı zamanda kullanıcının dışkı muayenelerini yapmadaki teknik yeterliliğine ve deneyimine de bağlıdır.
Sonuç olarak, dışkıdaki köpek parazitlerinin tespiti için başka yöntemler araştırılmıştır. Köpeklerde bağırsak helmint enfeksiyonlarının teşhisi için en yaygın kullanılan yaklaşımlardan birinin, bir tüpteki yüzdürme protokolü ve McMaster tekniği ile karşılaştırıldığında köpeklerde A. caninum tanısı için doğru ve güvenilir sonuçlar veren çok değerli, hassas ve doğru bir yöntem olan FLOTAC tekniği olduğu genel olarak kabul edilmiştir19, 23. Sedimantasyon yöntemleri, fluke yumurtalarının, embriyonlu nematod yumurtalarının ve çoğu tenya yumurtasının geri kazanılması için kullanışlıdır, bu yapılar yüzmediği için bir yüzdürme çözeltisinin yüzeyinde geri kazanılamaz24. Yüzdürme/sedimantasyon tekniklerinden daha üstün olduğu kanıtlanmış bir yöntem, dışkıda sestod yumurtalarının saptanmasını sağladığı, daha az zaman aldığı, Anoplocephala yumurtalarını dışkı kalıntılarından ayırdığı ve kristalleşmeyi azalttığı için Modifiye Çift Santrifüj Flotasyon yöntemidir25. Ayrıca, bu teknik, yüksek hassasiyete sahip ascarid yumurtalarını tespit etmek için başarıyla kullanılmıştır26. Yine de, yukarıda bahsedilen bu tekniklerden bazıları ve Ovassay gibi santrifüj yöntemleri, bu çalışmada önerdiğimiz yüzdürme protokolünün aksine, formalin, ticari kitler, laboratuvar koşullarında numune işleme gibi reaktiflerde numune muhafazasını ve çinko sülfat27 gibi pahalı olan ve çevresel toksisiteyi önlemek için özel imha prosedürleri gerektiren reaktiflerin kullanılmasını gerektirir.
Yüksek SpG'li solüsyonlar ekleyerek flotasyon yönteminin hassasiyetini arttıran tekniklerin kullanılması son zamanlarda tercih edilmektedir. Bununla birlikte, bu çözümlerin dezavantajının, son preparasyonda döküntülerin artması ve dolayısıyla parazit yumurtalarının yanlış tespiti olduğu düşünülmelidir. Ek olarak, malzemelerin, reaktiflerin ticari mevcudiyeti, maliyet, çevresel etki sorunları ve santrifüj yöntemlerinin kullanım zorluğu, bu çalışmada sunduğumuz protokolün aksine saha koşullarında zor olabilen bir yüzdürme tekniğinin14 seçimini etkiler. Yüzdürme çözeltilerinin sofra tuzu ile hazırlanması şeker kullanımına göre avantajlıdır çünkü tarla koşullarında şeker, yaban arısı ve arı gibi böcekleri çeker ve müstahzarlar yapışkan hale gelir. Ayrıca, yapışkanlığı önlemek için şeker çözeltilerine eklenen fenol veya ZnS04 gibi çözeltiler, çevre koruma yönergelerine göre uygun şekilde atılmak için karmaşıktır ve sahada atılamaz; sofra tuzu çözeltisinin aksine.
Bu makalenin amacı, tarla ve laboratuvar koşullarında basit yüzdürme tekniğinin bir uyarlamasını kullanarak dışkı örneklerinde T. canis ve Ancylostoma spp. yumurtalarını tespit etme adımlarını göstermektir. Burada açıklanan protokolü takiben ve yedek pilli bir mikroskop kullanarak, kırsal ve banliyö alanlarında bu köpek zoonotik parazitlerinin teşhisi, laboratuvar ekipmanı ve altyapısı mevcut olmadığında mümkündür. Bu çalışmada açıklanan basit yüzdürme yöntemi hızlı sonuçlar sağlayabilir ve rutin tarama için non-invaziv ve uygun maliyetli bir tekniktir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Köpeklerin kullanımı ve bakımı Meksika Ulusal ve Özerk Üniversitesi tarafından onaylandı.
1. Dışkı örneklerinin toplanması
NOT: Köpeği bir veteriner veya hayvanın sahibinin yardımıyla tutun.
- Yabani köpekler (Şekil 1A) veya gergin hayvanlar söz konusu olduğunda, dışkılamadan hemen sonra veya en fazla 10 dakika sonra yerden örnekler toplayın.
- Cerrahi eldivenleri veya ince duvarlı polietilen torbaları su veya vazelin ile yağlayın. Rektumdan dışkı örnekleri toplamak için cerrahi eldiven veya ince duvarlı polietilen torbalar kullanın.
- Her köpekten en az 2 g dışkı toplayın (Şekil 1B).
- Tek tek dışkı örneklerini şu şekilde tanımlayın: tarih, konum (Google Haritalar'ı kullanarak Küresel Konumlandırma Sistemi [GPS] koordinatları), her hayvan için bir kimlik numarası atayın, köpeğin yaklaşık yaşı, köpeğin cinsiyeti, cins, iç veya dış mekan (vahşi) köpek.
- Dışkı örneğini içeren torbaları sıkı bir düğümle kapatın. Dışkı numuneleri alındıktan sonra 3-4 saat içinde analiz edilmezse, torbaları buzdolabında (4-8 °C) saklayın.
2. Saha teşhisi için doymuş bir tuz çözeltisinin hazırlanması
NOT: Suyu kaynatmak için teraziye, ölçüm malzemesine, sobaya veya gaza erişim yoksa veya sınırlıysa, doymuş tuzlu su çözeltisi su, genel sofra tuzu, plastik 12 oz (355 mL) fincan ve 1 L soda plastik boş şişe kullanılarak kolayca hazırlanabilir.
- Boş bir 1 L soda şişesini iyice yıkayın. Şişeyi 1 L su ile doldurun.
- 12 oz'luk plastik bir bardağı ortak sofra tuzu ile doldurun.
- Tuzu soda şişesine aktarın.
- Soda şişesini vidalı kapakla sıkıca kapatın. Tuz artık çözünmeyene kadar çözeltiyi kuvvetlice çalkalayın.
NOT: Tuzun tamamen eriyene kadar çözeltiyi soda şişesinde çalkalamak 90 dakika kadar sürebilir.
3. Laboratuvar tanısı için doymuş bir tuz çözeltisinin hazırlanması
- 420 g ortak sofra tuzu ağırlığında.
- 420 g tuzu 1 L suda eritin.
- Çözeltiyi daha fazla tuz eriyene kadar kaynatın.
- Çözünmemiş tuzu atmak için çözeltiyi süzün.
- Ağır bir sıvı hidrometresi veya dansitometre kullanarak çözeltinin konsantrasyonunu kontrol edin.
NOT: Daha iyi sonuçlar elde etmek için ideal konsantrasyonun SpG'si 1.20'dir (Şekil 2A). Bir yumurtanın yüzdürme kabiliyeti, çözelti ile etkileşiminden etkilenir ve yumurtaların aynı özgül ağırlığa sahip çözeltilerde yüzdürme kabiliyetine katkıda bulunur. Bu nedenle, optimum yumurta geri kazanımını elde etmek için, yüzdürme çözeltisindeki üst özgül ağırlık aralığını dikkate almak ve hedeflenen parazit elementlerininkini aşmasını sağlamak önemlidir6.
4. Yüzdürme yöntemi
NOT: Dışkı örnekleri çok kuru veya sertse, bunları bir havanda yumuşatın.
- Bir kaşık kullanarak, yaklaşık 3 g dışkıyı bir plastik kaba (~8,5 cm yüksekliğinde ve ~5,5 cm çapında) koyun.
- Bir macun elde edilene kadar 1 mL doymuş tuz çözeltisi ekleyin.
- 1 dakika karıştırın ve 100 mL doymuş tuz çözeltisi ekleyin.
- Kaba parçacıkları önlemek için bu süspansiyonu plastik bir süzgeçten ikinci bir plastik kaba geçirin (Şekil 2B).
- Süspansiyonu 15-20 dakika bekletin.
- Yumurta, kist veya ookist içermediğinden emin olmak için 1 saniye boyunca aleve bir aşılama halkası yerleştirin (Şekil 2C).
- Aşılama döngüsünün soğuması için 5 saniye bekleyin (Şekil 2D).
- Aşılama halkası ile süspansiyon yüzeyinden üç damla alın. Üç damlanın her birini ayrı ayrı bir cam slayt üzerine yerleştirin (Şekil 2E-G)
NOT: Damlaların birbiriyle temas etmediğinden emin olun (Şekil 2H). - Mikroskop altında 10x objektifle gözlemleyin (Şekil 2I). Büyütme 40x'e yükseltilirse bir lamel yerleştirin.
- Damlacıkta pozitif bir sonuç gözlendiğinde, dışkı süspansiyon yüzeyinin rastgele bölgelerinde patent döneminde parazitlerin varlığını kaydetmek için laboratuvar kayıt defterine bir çarpı (+) atayın.
5. Yüzdürme yönteminin yorumlanması
NOT: Olumsuz sonuçlar kesin değildir.
- Testin hassasiyetini artırmak için art arda 3 günden alınan numunelerle bir dizi üç test gerçekleştirin.
NOT: Olumlu sonuçlar, patent döneminde parazitlerin varlığını gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, T. canis ve Ancylostoma spp.'nin tanımlanması için toplama ve koproparasitoskopik prosedürler anlatılmıştır. Köpek helmint yumurtalarını tespit etmek için basit dışkı yüzdürme yönteminin uyarlanmasının arkasındaki mantık, çözümler, ekipman ve malzemeler ucuz olduğu için bu tekniğin uygun maliyetli olmasıdır. Bu nedenle, kısa sürede birden fazla numune işlenebildiğinden yöntem yüksek bir numune işleme kapasitesine sahiptir. Ayrıca, basit dışkı yüzdürme yönteminin uygulanması kolaydır ve nispeten hassastır.
Örneklem büyüklüğü ve hayvan seçimi, esas olarak hayvan sahibinin istekliliği ve yaklaşan vahşi köpeklerin güvenliği ile belirlenen rahatlıkla yapılmıştır. Bu çalışmada, 2017'den başlayarak 4 yıl boyunca Meksika'da Canis lupus familiaris köpeklerinde Ancylostoma spp. ve T. canis oluşumlarını ve sıklıklarını değerlendirmek için yüzdürme yöntemi kullanılmıştır. 1.638 köpekten dışkı örnekleri toplandı ve mikroskobik olarak tarandı. Toplam 1.235 köpek T. canis ve Ancylostoma spp. için pozitifti. Yüzdürme yöntemini kullanmanın amaçlarından biri, Toxocara veya Ancylostoma oluşumunu ölçmedeki etkinliğini göstermekti, ancak aynı zamanda prevalansını etkileyebilecek faktörlerin daha derin bir incelemesini yapmayı da amaçladık. Sonuç olarak, karışık enfeksiyonları olan 185 hayvan atıldı. Ancylostoma spp. için pozitif örnek sayısı 833 (%78.95) ve T. canis için 222 (%21.04) idi. 1.050 numunenin %75,5'i (793 numune), bir soda şişesi ile yüzdürme çözeltisi hazırlanarak ve 4 saat sürekli çalışma için 3 x 1,2 V AA şarj edilebilir pilli bir mikroskop kullanılarak saha ortamında işlendi ve okundu. Kalan 257 dışkı örneği laboratuvarda incelendi.
Bu çalışmanın amacı, laboratuvar altyapısı veya ekipmanının bulunmadığı alanlarda köpeklerin iki helmint parazitinin teşhisini hızlandırmak ve kolaylaştırmak için bir yüzdürme solüsyonu ve saha ortamında bir yöntem kullanmaktı. Yüzdürme yönteminin saha uygulaması, antelmintik tedaviler ve önleyici tedbirler hakkında önerilerde bulunmak ve böylece insanlarda veya evcil hayvanlarda parazit yayılmasını önlemek için her mikroskobik okumadan hemen sonra bulguları 400 sahibine iletmemizi sağladı. Aynı şekilde, tarla ortamındaki yüzdürme tekniği, vahşi köpekleri incelemeyi ve onlara ödül maması veya yiyecek kullanarak antelmintik bir tedavi sağlamayı mümkün kılmıştır. Şekil 3A ve Şekil 3B , yüzdürme çözeltisi ve tekniği tarla ortamında yapıldıktan sonra gözlemlenen sırasıyla T. canis ve Ancylostoma spp. yumurtalarını göstermektedir. Taze dışkı örnekleri tarla ortamında yüzdürme yöntemine tabi tutulduğunda, bir soda şişesinde hazırlanan çözelti, helmint yumurtalarını yüzdürme yeteneğine sahipti. Tuz kristalleri ve hava kabarcıklarının üretimi, laboratuvar ortamında okunan numunelerle karşılaştırıldı ve operatör tarafından herhangi bir fark tespit edilmedi. Bu gözlem cesaret vericidir ve dışkı örneklerinin konsantrasyonunun daha doğru bir mikroskobik okumayı garanti ettiği bilgisine meydan okumaktadır.
Yüzdürme çözeltisi ve dışkı örnekleri laboratuvar ortamında işlendiğinde, parazitlerin hem sahada hem de laboratuvar kopromikroskopik tespitinde aynı miktarda enkaz aynı anda yüzdüğü için mikroskop altındaki okumaların morfolojisi ve netliği açısından hiçbir fark algılanmadı. Şekil 3A,B , kentsel, banliyö ve kırsal alanlardan örneklerin taşınmasından sonra tam donanımlı bir laboratuvar ortamında işlenen 257 örnekten elde edilen sırasıyla T. canis ve Ancylostoma spp. yumurtalarını göstermektedir. Bu parazit yumurtaları, tarla koşullarında gözlemlenenlerden morfolojik olarak farklı değildi (Şekil 3C).
Bu protokol, T. canis ve Ancylostoma spp. prevalansında lokalizasyon, yılın mevsimi, cinsiyet, ırk, yaş ve dış veya iç mekan koşullarının etkisini değerlendirmek için yeterli sayıda bulgu üretti. Prevalans verileri ANOVA Testi kullanılarak 0.05 anlamlılık değeri ile karşılaştırıldı. Tablo 2, T. canis'in ılıman ve kuru iklimlerde, sıcak iklimlerle karakterize edilen eyaletlere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir dağılım sıklığı sergilediğini, oysa Ancylostoma spp.'nin baskın sıcak, ılıman veya kuru iklime sahip bölgeler arasında. Aynı şekilde, Ancylostoma spp. ve T. canis en sık yaz aylarında tespit edilir. Erkeklerin %60,86'sında ancylostomiasis, %37,38'inde toksokariazis pozitif olduğu saptandı. Ayrıca, T. canis 6 aylıktan küçük yavrularda daha sık tespit edildi; Ancylostoma spp. ise yetişkin köpeklerde daha fazla teşhis edildi. İlginç bir şekilde, köpek ırkları arasında hiçbir fark bulunamadı. Köpek kancalı kurt, açık hava köpeklerinin% 65.54'ünü enfekte etti; yine de, T. canis , dış mekan veya iç mekan statüsündeki köpeklerde eşit olarak tespit edildi.
Şekil 1: Köpeklerden dışkı örneği toplama. (A) Yabani köpeklerden dışkı örnekleri alınırken dikkatli olunmalıdır. Mümkün olduğunda, taze dışkı toplanmalı ve laboratuvarda teslim ve koproparasitoskopik analiz için plastik bir torbada saklanmalıdır. Numuneler 4 °C'de soğutulmalı ve toplandıktan sonraki 24 saat içinde strafor kutulara veya yalıtımlı metal zarflara yerleştirilmelidir. (B) Standart olarak üç gram dışkı tavsiye edilir; Bu nedenle, 2-5 g makul. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Doymuş bir tuz çözeltisinin hazırlanması ve dışkı süspansiyonunun mikroskopi için işlenmesi. (A) Tuzla yapılan doymuş bir çözeltinin ideal yoğunluğu 1.20'nin üzerinde olmalıdır. Altta kristal olmadığını ve çözeltinin şeffaf olduğunu kontrol etmeniz şiddetle tavsiye edilir. (B) Dışkı süspansiyonunun plastik bir süzgeçten geçirilmesi kaba parçacıkları giderir. (C) Aşılama döngüsü, kontaminasyon içermediğinden emin olmak için bir aleve (bir laboratuvar brülörü veya ortak bir portatif çakmak) maruz bırakılmalıdır. (D) Aşılama döngüsünün soğumasını bekleyin ve süspansiyonun yüzeyindeki farklı bölgelerden üç damla alın. (E) İlk damlacığı cam kızağa yerleştirdikten sonra, damlacığın dökülmesini azaltmak için sürgüyü hareket ettirmekten kaçının. Cam slayt, numunelerin gözlemlenmesine izin veren ince ve şeffaf bir platform sağlar. (F) İkinci damlacığı cam kızağın ortasına yerleştirin. Dışkı süspansiyonunun yüzeyinden ikinci bir damla almak, parazitik yapıların eşit olmayan bir şekilde dağılmış olabileceği bir süspansiyonda yumurta bulma olasılığını arttırır. (G) Üçüncü damlacığı cam kızağa yerleştirin. Dışkı süspansiyonunun yüzeyinden üçüncü bir damla, yüzen yumurtaların yoğunlaşmış olabileceği başka bir alanın gözlemlenmesine izin verecektir. (H) Dışkı süspansiyonunun yüzeyinin farklı bölgelerinden nematod yumurtalarını tespit etmek için cam slayt üzerinde üç damla ayrı ayrı gözlenir. (I) 10x objektifi kullanarak numuneyi mikroskop altında gözlemleyin. Hedef 40x olarak değiştirilirse, dışkı süspansiyon damlacıklarının üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Damlacıkta pozitif bir sonuç gözlendiğinde, dışkı süspansiyon yüzeyinin rastgele bölgelerinde patent döneminde parazitlerin varlığını işaretlemek için bir çarpı (+) atayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Toxocara canis ve Ancylostoma spp. yumurtaları 40x büyütme kullanılarak ışık mikroskobu ile tespit edilmiştir. (A) Toxocara canis yumurtaları, 40x büyütme kullanılarak ışık mikroskobu ile tespit edildi. Yüzdürme yöntemi, kaba malzemelerden arındırılmış temiz mikroskobik alanların görselleştirilmesine izin verdi (bir tarla ortamında toplanmış). Yüzdürme çözeltisinin hazırlanma yönteminden bağımsız olarak, yumurtalar görülebildi ve esas olarak morfolojik değişiklikler olmadan gözlendi. (B) Ancylostoma spp. 40x büyütme kullanılarak ışık mikroskobu ile tespit edildi. Dışkı konsantrasyonu gerçekleştirilmemiş olsa da (tarla ortamında), basit yüzdürme yöntemi, prosedür mevcut yönteme göre yapıldığında dışkıdaki yumurtaların morfolojik tespitinin eksikliklerini giderdi. (C) T. canis ve Ancylostoma spp. 40x büyütme kullanılarak ışık mikroskobu ile tespit edildi. Bu yumurtaların morfolojik özellikleri (laboratuvar ortamında elde edilen), dışkı örneklerinin konsantrasyonu yapılmamasına rağmen açıktı ve tarla ortamında elde edilen yumurtalardan farklı değildi. Ölçek çubukları = 75 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Ancylostoma spp. | Toxocara canis | ||
| İklim | Sıcak iklim | 38,66bir | 22.52bir |
| Kuru iklim | 29.41bir | 36.03bir | |
| Ilıman iklim | 31.93bir | 41.44milyar | |
| İlkbahar | 23.76bir | 19.81bir | |
| Yaz | 49.81milyar | 50.00b | |
| Sonbahar | 17.52bir | 20,27bir | |
| Kış | 8,88c | 9.90c | |
| Cinsiyet | Erkek | 60.86bir | 62,61bir |
| Dişi | 39.13b | 37.38milyar | |
| Yaş | 0-3 aylık | 18,72bir | 51.80bir |
| 3-6 aylık | 15.48bir | 32.43milyar | |
| > 6 ay | 22.44bir | 10.36derece | |
| > 1 yıl | 43.33milyar | 5.40c | |
| Doğurmak | Melez | 52,78bir | 55,86bir |
| Purebred | 47.22bir | 44.14bir | |
| Konut durumu | Kapalı | 34.45bir | 52,25bir |
| Açık | 65.54bir | 47.74milyar |
Tablo 2: Meksika'daki köpeklerde 4 yıl boyunca iklim, mevsim, cinsiyet, yaş, ırk ve barınma durumuna göre Ancylostoma spp. ve Toxocara canis prevalansı (%) Verilerden elde edilen göstergeler, Ancylostoma spp. sıcak, ılıman veya kuru iklimlerle karakterize edilen alanlarda. Buna karşılık, T. canis , ılıman ve kuru iklimlerde sıcak iklimlere kıyasla belirgin şekilde daha yüksek bir prevalans sergiler. Ek olarak, hem Ancylostoma spp. hem de T. canis en sık yaz mevsiminde tanımlanır. Verilerin analizi ayrıca erkek köpeklerin %60.86'sının ancylostomiasis için pozitif test ettiğini, %37.38'inin ise toksokariazis için pozitif test ettiğini göstermektedir. Ayrıca, T. canis 6 aylıktan küçük yavru köpeklerde daha sık görülürken, Ancylostoma spp. yetişkin köpeklerde daha yaygındır. İlginç bir şekilde, çeşitli köpek ırkları arasında fark edilebilir bir fark gözlenmedi. Bulgular, açık hava köpeklerinin %65,54'ünün köpek kancalı kurdu ile enfekte olduğunu, T. canis'in ise iç ve dış mekan köpekleri arasında eşit derecede yaygın olduğunu göstermektedir. *Faktörün (İklim, Mevsim, Cinsiyet, Yaş, Irk ve Barınma) bir sütunundaki ortalama değerler ve ardından aynı harfler ANOVA Testine göre P < 0.05'te anlamlı olarak farklı değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T. canis ve Ancylostoma spp. gibi nematodlar köpeklerin ince bağırsağında yaşayabilir ve insanlara bulaşma potansiyeline sahiptir. T. canis'in neden olduğu klinik belirtiler genç köpeklerde ciddidir ve zayıf büyüme, solunum sorunları veya sindirim sistemi lezyonları olarak kendini gösterir28. Yetişkin köpeklerde enfeksiyon tipik olarak hafif olma eğilimindedir. Teşhis, dışkı örneğindeki karakteristik yumurtaların tanımlanmasına dayanır. Bu durum, köpeklere antelmintik tedavi reçete etmek için sık görülen bir nedendir29. Toxocara'nın epidemiyolojisini anlamak için, parazitin anneden yavruya hem doğumdan önce plasenta yoluyla hem de yavrulamadan kısa bir süre sonra galaktojenik bir enfeksiyon olarak emzirme yoluyla geçebileceğini bilmek önemlidir. İnsanlar, kontamine toprak veya enfekte bir köpeğin kürkü gibi çeşitli yollarla ortaya çıkabilen enfektif yumurtaları yutarken T. canis ile sözleşme yapabilir. Bu durumda, insanlar paratenik konakçılar olarak hizmet eder ve parazitik üreme olmasa da, yumurtalardan salınan larvalar, özellikleçocuklar 30 söz konusu olduğunda potansiyel olarak zarar verebilir.
Kancalı kurt Ancylostoma spp. ile enfeksiyon köpeklerde, hayvanlar larvaları yuttuğunda veya larvalar cilde nüfuz ettiğinde ortaya çıkar. Yavru köpekler, paratenik bir konakçı tüketerek veya laktojenik yol31 yoluyla enfeksiyona yakalanabilir. Olgun kancalı kurtlar kanla beslenir ve özellikle genç köpeklerde potansiyel olarak ciddi anemi ve gastrointestinal semptomlara yol açar. Deri yoluyla meydana gelen enfeksiyonlar, tipik olarak enfeksiyonun başlamasından yaklaşık bir hafta sonra düzelen dermatit ile sonuçlanır. Destekleyici tedavi eşliğinde çeşitli antelmintik ilaçlar kullanılmıştır. Bununla birlikte, antelmintik direnç raporları vardır. Ancylostoma , insanlar için patojenik olma potansiyeline sahiptir. L3 larvalarının transkutanöz iletimi, kutanöz larva migrans olarak bilinen bir duruma yol açabilir. Bu lezyonlar genellikle birkaç ay içinde tedavi olmaksızın düzelir. Nadir durumlarda, köpek kancalı kurtları insan gastrointestinal sistemine göç ederek eozinofilik enteriteneden olabilir 30.
Köpeklerde parazitozun doğru, ekonomik ve hızlı teşhisi, köpek helmintiyazları hakkındaki epidemiyolojik bilgimizi artırmak için çok önemlidir. Bu nedenle, T. canis ve Ancylostoma spp.'yi tespit etmek için bir tarla ortamında kullanılacak basit yüzdürme tekniğinin bir protokolünü uyarladık. Mevcut protokolde karşılaşılan ilgili bir sorun, vahşi köpeklerden örneklerin toplanmasıydı, çünkü bu hayvanların kullanımı genellikle zor. Bu nedenle, örnekleme, köpekleri dışkılayana kadar gözlemleyerek ve takip ederek yapıldı, bu da örnekleme yöntemini zaman alıcı, zorlu ve bir şekilde tehlikeli hale getirdi. Deneyimlerimize göre, barınak köpeklerinde parazitolojik çalışmaların değerlendirilmesini şiddetle tavsiye ediyoruz.
Zoonotik helmint yumurta geri kazanımı ile ilgili olarak, kalitatif koprooskopi, parazitoloji laboratuvarında tanı amaçlı yaygın olarak kullanılan metodoloji olmaya devam etmektedir1. Önceki çalışmalar, doymuş bir tuz çözeltisi kullanan yüzdürme tekniğinin doğrudan mikroskopiden daha güvenilir olduğunu bulmuştur. Örneğin, Dryden ve işbirlikçileri, yüzdürme tekniği ile işlenen 206 dışkı örneğinde Ancylostoma spp. yumurtaları için %95.15 ve direkt mikroskopi ile %27.18 duyarlılık belirlemişlerdir32. Flotasyon çözeltisinin yoğunluğunun flotasyon yöntemi 14,20,23 için kritik bir faktör olduğu kabul edilmektedir. Bu yoğunluğa ulaşmayan çözeltilerde, parazitik formların yüzmesi daha uzun sürer veya hiç yüzmez. Bir yüzdürme çözeltisi aşırı doyduğunda, birkaç dakika içinde ve hatta bir lamelyerleştirilirse daha erken kristalleşir 20.
Bu protokolde yüzdürme çözümünün seçimi, hazırlık kolaylığı, kolaylık, maliyet ve çevresel etkiye dayanıyordu. Şeker çözeltisinin kristalleşmesi daha uzun sürse de, koruyucu olarak formalin veya fenol eklenmeli ve yapışkan veya yapışkan hissi azaltmalıdır; Bu, bu çalışmada hakim olan saha koşulları altında bir rahatsızlıktır. Ayrıca, kimyasal reaktiflerin imhası, çevresel düzenlemeler nedeniyle karmaşık bir konudur. Bu çalışmadaki veriler, bir flotasyon çözeltisi hazırlamak ve kaynatmak için laboratuvar ekipmanının bulunmaması nedeniyle bir soda şişesi kullanılarak tarla koşullarında ortak sofra tuzu ile hazırlanan doymuş çözeltinin, laboratuvar ortamında hazırlanan çözelti kadar etkili olduğunu göstermiştir. Algılanabilir tek fark, şeffaf bir çözelti görülene kadar soda şişesini sallamanın daha uzun sürmesidir. Mikroskobik gözlemler, doymuş çözeltiyi hazırlamak için her iki yöntem kullanılarak hazırlanan numune için eşit derecede temizdi. Yukarıda belirtilen ifadeyi doğrulamak için gelecekte daha fazla sayıda örnekle daha fazla çalışma yapılması önemlidir. Yine de zaman alıcıdır ve çözeltiyi şişenin içinde saatlerce çalkalamak için fiziksel çaba gerektirir. Protokolün bir diğer kritik adımı, yumurtaların yüzmesine ve yüzeyde konsantre olmasına izin vermek için dışkı süspansiyonunun en az 15 dakika bekletilmesidir. Bununla birlikte, dinlenme süresi ne kadar uzun olursa, o kadar fazla döküntü yüzer ve birkaç saat sonra yumurtalar deforme olur veya kırılır. Koproparazitoskopik yöntemlerin duyarlılık ve özgüllüğünün düşük olduğu ve bu yöntemlerin tanısal test olarak doğruluğunun kullanıcının becerisine bağlı olduğu göz önünde bulundurularak, bu çalışmada flotasyon tekniği eğitimli ve deneyimli parazitologlar tarafından uygulanmış ve parazitler tanımlanmıştır.
Bildiğimiz kadarıyla bu çalışma, prevalansını tahmin eden ilk çalışmadır Ancylostoma spp. ve T. canis Meksika'daki köpeklerde, tarla ortamında basit yüzdürme yöntemiyle incelenen dışkı örneklerini kullanarak. Burada, kullandığımız yüzdürme tekniğinin, onlarca yıldır kullanılmasına rağmen, hala oldukça etkili, ekonomik ve hızlı bir tanı testi olduğu gösterilmiştir14. Buna rağmen, köpek helmintlerinin teşhisi için kullandığımızdan daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip koproparasitoskopik teknikler vardır; Faust tekniğinde olduğu gibi sedimantasyon konsantrasyonu gibi. Ayrıca, bir konsantrasyon yöntemi olan Faust'un Giardia33 gibi protozoaların tespitinde daha etkili olduğu da gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu çalışma için seçtiğimiz koproparasitoskopik yöntemin maliyet gibi birçok avantajı vardı. Faust tekniği, santrifüj gibi ek ve pahalı ekipman gerektirdiğinden, tuzlu suya doymuş çözelti ile yüzdürmeden daha pahalıdır. Çinko sülfat gibi reaktifler kullananlar gibi diğer konsantrasyon yöntemleri, normal tuzdan daha pahalıdır ve santrifüjde gerekli yıkama sayısı nedeniyle daha fazla zamana ihtiyaç duyar. Bu nedenle, Faust tekniği, bir santrifüje erişimin yaygın olmadığı saha çalışmalarında kullanımı için sınırlıdır.
En önemlisi, basit yüzdürme tekniğinin bir sınırlaması, Cryptosporidium ookistlerini, Giardia kistlerini veya Trichuris yumurtalarını tespit edecek kadar hassas olmamasıdır. Bu nedenle, bu türlerin teşhisi amaçlanıyorsa, parazit formlarını konsantre etmek için santrifüj prosedürlerini kullanan teknikler kullanılmalıdır. Bu çalışmada bildirilen cinslerin pozitiflik oranlarının, örnekleme stratejisi olarak bir kolaylık yöntemi kullanıldığı için kesin olarak kabul edilmemesi gerektiğinin altını çizmek önemlidir. Köpeklerde helmint parazitlerini tanımlamanın çok önemli hale geldiği, zorlu hayvan yönetimine sahip barınaklar gibi durumlar olabileceğini unutmamak önemlidir. Sonuç olarak, bu protokolün gelecekte birleşik numunelerin toplanmasına uyum sağlamak için ayarlamalara ihtiyacı olabilir.
Zayıf bir nokta olarak, basit yüzdürme yönteminin ve doymuş NaCl çözeltisinin hazırlanmasının belirli bir amaç için geliştirildiğine dikkat edilmelidir - çoğunlukla tarla koşullarında köpek dışkısını incelemek için - ancak basit yüzdürme prosedürünün duyarlılığının genellikle düşük olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, daha ağır parazit türlerinin kistlerini veya yumurtalarını tespit etmek için bir konsantrasyon tekniğinin kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Basit yüzdürme yönteminin düşük duyarlılığı göz önüne alındığında, bir tarla veya laboratuvar ortamında gerçekleştirilip gerçekleştirilmediğine bakılmaksızın, bu tekniğin köpek helmint parazitlerinin epidemiyolojik çalışmaları için tercih edilen bir yöntem olarak yararlı olup olmayacağından şüphe etmek mantıklıydı. Bununla birlikte, bu çalışmada köpeklerde yüksek Ancylostoma spp. prevalansı ve T. canis yumurtalarının saptanması, ister tarlada ister laboratuvar ortamında gerçekleştirilsin, basit yüzdürme yönteminin, daha ileri epidemiyolojik çalışmaları destekleyebilecek kanıtlar sağlamak ve köpeklerin ve insanların bu nematodlarla enfeksiyonunu azaltmak için kontrol ve önleyici tedbirler önermek için yararlı olduğunu göstermektedir.
Basit yüzdürme yöntemini kullanarak, köpek dışkısından T. canis ve Ancylostoma spp. yumurta geri kazanımını etkileyen faktörleri analiz ettik. T. canis bulguları, parazitlerin ılıman ve tropikal bölgelerde daha yaygın olduğunu gösteren en son araştırmalarla uyumluydu. Bu, çevresel faktörlerin, özellikle sıcaklık ve yağışın, parazit türlerinin ekolojik aralığını nasıl etkilediğini araştıran önceki çalışmalarlauyumludur 34,35,36. Mevcut sonuçlar, her iki helmintin de erkekleri önemli ölçüde daha yüksek oranda enfekte ettiğini göstermiştir. Bu bulgunun, erkeklerin immünolojik olarak enfeksiyonlara karşı daha az reaktif olmasından kaynaklandığını tahmin etmek mantıklıdır37,38. Yavru köpekler bu parazitten daha fazla etkilendiği için yaş T. canis prevalansını etkiler. Bu bulgu, bu parazitin yavruları daha fazla etkileme eğiliminde olduğunu, yetişkinlerin ise artan direnç geliştirdiğini ve bunun da enfeksiyon olasılığının daha düşük olmasına neden olduğunu gösteren daha önceki araştırmalarla uyumludur 6,39. Hem melez hem de safkan köpekler, Toxocara canis ve Ancylostoma spp.'nin karşılaştırılabilir prevalansını gösterdi. Bununla birlikte, yabani köpekler daha yüksek bir prevalans sergiledi Ancylostoma spp. ev ortamlarında yaşayan köpeklere kıyasla. Bu bulgu, köpek ırkları arasındaki farklılıkları tespit etmeyen önceki raporlarla uyuşmamaktadır6. Doymuş salin solüsyonunun hazırlanmasının ve bu protokolde kullanılan basit yüzdürme yönteminin gelecekteki uygulamalarının saha veya laboratuvar koşullarında rutin dışkı muayeneleri için yapılabileceği sonucuna varılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Universidad Nacional Autónoma de México'nun Dirección General de Asuntos del Personal Académico'suna, PAPIIT IN218720 hibe yoluyla mali kaynakları sağladığı için ve Dr. Claudia Mendoza'ya talep edilen uzatmayı sağladığı için minnettardır. Bu eser, 2019'da vefat eden sevgili Nicole'üme ithaf edilmiştir. Her zaman kalbimde yaşayacaksın.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
References
- Duncan, K. T., Koons, N. R., Litherland, M. A., Little, S. E., Nagamori, Y. Prevalence of intestinal parasites in fecal samples and estimation of parasite contamination from dog parks in central Oklahoma. Veterinary Parasitology Regional Studies and Reports. 19, 100362 (2020).
- Kisiel, L. M., et al. Owned dog ecology and demography in Villa de Tezontepec, Hidalgo, Mexico. Preventive Veterinary Medicine. 135, 37-46 (2016).
- Lyons, M. A., Malhotra, R., Thompson, C. W. Investigating the free-roaming dog population and gastrointestinal parasite diversity in Tulúm, México. PLoS One. 17 (10), e0276880 (2022).
- Dantas-Torres, F., et al. TROCCAP recommendations for the diagnosis, prevention and treatment of parasitic infections in dogs and cats in the tropics. Veterinary Parasitology. 283, (2020).
- Cantó, G. J., García, M. P., García, A., Guerrero, M. J., Mosqueda, J. The prevalence and abundance of helminth parasites in stray dogs from the city of Querétaro in central Mexico. Journal Of Helminthology. 85 (3), 263-269 (2011).
- Torres-Chablé, O. M., et al. Prevalence of gastrointestinal parasites in domestic dogs in Tabasco, Southeastern Mexico. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 24 (4), 432-437 (2015).
- Cortez-Aguirre, G. R., Jiménez-Coello, M., Gutiérrez-Blanco, E., Ortega-Pacheco, A. Stray dog population in a city of Southern Mexico and its impact on the contamination of public areas. Veterinary Medicine International. 2018, 1-6 (2018).
- Rodríguez-Vivas, R. I., et al. An epidemiological study of intestinal parasites of dogs from Yucatán, Mexico, and their risk to public health. Vector Borne Zoonotic Diseases. 11 (8), 1141-1144 (2011).
- Maggi, R. G., Krämer, F. A review on the occurrence of companion vector-borne diseases in pet animals in Latin America. Parasites & Vectors. 12 (1), 145 (2019).
- Cruz-Vazquez, C., Castro, G., Parada, F., Ramos, P. Seasonal occurrence of Ctenocephalides felis and Ctenocephalides canis (siphonaptera:Pulicidae) infesting dogs and cats in an urban area in Cuernavaca, Mexico. Entomological Society of America. 38 (1), 111-113 (2001).
- Bolio-Gonzalez, M. E., et al. Prevalence of the Dirofilaria immitis infection in dogs from Mérida, Yucatán, Mexico. Veterinary Parasitology. 148 (2), 166-169 (2007).
- Pastor-Santiago, J. A., Flisser, A., Chávez-López, S., Guzmán-Bracho, C., Olivo-Díaz, A. American visceral leishmaniasis in Chiapas, Mexico. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86 (1), 108-114 (2012).
- Trasviña-Muñoz, E., et al. Detection of intestinal parasites in stray dogs from a farming and cattle region of Northwestern Wexico. Pathogens. 9 (7), (2020).
- Ballweber, L. R., Beugnet, F., Marchiondo, A. A., Payne, P. A. American Association of Veterinary Parasitologists' review of veterinary fecal flotation methods and factors influencing their accuracy and use--is there really one best technique. Veterinary Parasitology. 204 (1-2), 73-80 (2014).
- Nielsen, M. K. What makes a good fecal egg count technique. Veterinary Parasitology. 296, 109509 (2021).
- Gordon, H. M., Whitlock, H. V. A new technique for counting nematode eggs in sheep faeces. Journal of the Council for Scientific and Industrial Research. 12 (1), 50-52 (1939).
- O'grady, M. R., Slocombe, J. O. D. An investigation of variables in a fecal flotation technique. Canadian Journal of Comparative Medicine. 44 (2), 148 (1980).
- ESCCAP. Worm control in dogs and cats. Guideline 01. European Scientific Counsel Companion Animal Parasites. , (2017).
- Cringoli, G., et al. Ancylostoma caninum: Calibration and comparison of diagnostic accuracy of flotation in tube, McMaster and FLOTAC in faecal samples of dogs. Experimental Parasitology. 128 (1), 32-37 (2011).
- Figueroa, C. J. A. Examen coproparasitoscópico. In: Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria, Consejo Técnico Consultivo Nacional de Sanidad Animal. AMPAVE-CONASA. , 83-105 (2015).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Adolph, C., et al. Diagnostic strategies to reveal covert infections with intestinal helminths in dogs. Veterinary Parasitology. 247, 108-112 (2017).
- Cringoli, G., Rinaldi, L., Maurelli, M. P., Utzinger, J. FLOTAC: New multivalent techniques for qualitative and quantitative copromicroscopic diagnosis of parasites in animals and humans. Nature Protocols. 5 (3), 503-515 (2010).
- Katagiri, S., Oliveira-Sequeira, T. C. Comparison of three concentration methods for the recovery of canine intestinal parasites from stool samples. Experimental Parasitology. 126 (2), 214-216 (2010).
- Rehbein, S., Lindner, T., Visser, M., Winter, R. Evaluation of a double centrifugation technique for the detection of Anoplocephala eggs in horse faeces. Journal of Helminthology. 85 (4), 409-414 (2011).
- Liccioli, S., et al. Sensitivity of double centrifugation sugar fecal flotation for detecting intestinal helminths in coyotes (Canis latrans). Journal of Wildlife Diseases. 48 (3), 717-723 (2012).
- Rishniw, M., Liotta, J., Bellosa, M., Bowman, D., Simpson, K. W. Comparison of 4 Giardia diagnostic tests in diagnosis of naturally acquired canine chronic subclinical giardiasis. Journal of Veterinary Internal Medicine. 24 (2), 293-297 (2010).
- Barutzki, D., Schaper, R. Endoparasites in dogs and cats in Germany 1999-2002. Parasitology Research. 90, S148-S150 (2003).
- Carlin, E. P., Tyungu, D. L. Toxocara: Protecting pets and improving the lives of people. Advances in Parasitology. 109, 3-16 (2020).
- Saari, S., NaReaho, A., Nikander, S. Canine parasites and parasitic diseases. , Academic Press. (2019).
- Bowman, D. D., Montgomery, S. P., Zajac, A. M., Eberhard, M. L., Kazacos, K. R. Hookworms of dogs and cats as agents of cutaneous larva migrans. Trends in Parasitology. 26 (4), 162-167 (2010).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Barutzki, D., Schaper, R. Results of parasitological examinations of faecal samples from cats and dogs in Germany between 2003 and 2010. Parasitology Research. 109, S45-S60 (2011).
- Novobilský, A., Novák, J., Björkman, C., Höglund, J. Impact of meteorological and environmental factors on the spatial distribution of Fasciola hepatica in beef cattle herds in Sweden. BMC Veterinary Research. 11, 128 (2015).
- Pickles, R. S., Thornton, D., Feldman, R., Marques, A., Murray, D. L. Predicting shifts in parasite distribution with climate change: A multitrophic level approach. Global Change Biology. 19 (9), 2645-2654 (2013).
- Pérez-Rodríguez, A., De La Hera, I., Fernández-González, S., Pérez-Tris, J. Global warming will reshuffle the areas of high prevalence and richness of three genera of avian blood parasites. Global Chaneg Biology. 20 (8), 2406-2416 (2014).
- Nava-Castro, K., Hernández-Bello, R., Muñiz-Hernández, S., Camacho-Arroyo, I., Morales-Montor, J. Sex steroids, immune system, and parasitic infections: Facts and hypotheses. Annals Of The New York Academy Of Sciences. 1262, 16-26 (2012).
- Morales-Montor, J., Escobedo, G., Vargas-Villavicencio, J. A., Larralde, C. The neuroimmunoendocrine network in the complex host-parasite relationship during murine cysticercosis. Current Topics in Medicinal Chemistry. 8 (5), 400-407 (2008).
- Olave-Leyva, J., et al. Prevalencia de helmintos gastrointestinales en perros procedentes del servicio de salud de Tulancingo, Hidalgo. Abanico Veterinario. 9 (1), 1-10 (2019).
