Summary
يحدد هذا البروتوكول إجراءات الحصول على الخلايا الظهارية الصبغية الأولية للشبكية (RPE) واستزراعها من عيون الخنازير من مصادر محلية. تعمل هذه الخلايا كبديل عالي الجودة للخلايا الجذعية وهي مناسبة لأبحاث الشبكية في المختبر .
Abstract
ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية حاسمة في شبكية العين الخارجية مسؤولة عن دعم المستقبلات الضوئية. يحدث تنكس RPE عادة في الأمراض التي تتميز بفقدان البصر التدريجي ، مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD). غالبا ما تعتمد الأبحاث حول AMD على عيون المتبرعين البشريين أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) لتمثيل RPE. ومع ذلك ، تتطلب مصادر RPE هذه فترات تمايز ممتدة وخبرة كبيرة للزراعة. بالإضافة إلى ذلك ، تفتقر بعض المؤسسات البحثية ، لا سيما تلك الموجودة في المناطق الريفية ، إلى سهولة الوصول إلى عيون المانحين. على الرغم من وجود خط خلايا RPE الخالد المتاح تجاريا (ARPE-19) ، إلا أنه يفتقر إلى ميزات RPE الأساسية في الجسم الحي وغير مقبول على نطاق واسع في العديد من منشورات أبحاث طب العيون. هناك حاجة ملحة للحصول على خلايا RPE أولية تمثيلية من مصدر متاح بسهولة أكبر وفعال من حيث التكلفة. يوضح هذا البروتوكول عزل الخلايا الأولية RPE التي يتم الحصول عليها بعد الوفاة من عيون الخنازير وثقافتها الفرعية ، والتي يمكن الحصول عليها محليا من الموردين التجاريين أو الأكاديميين. يتطلب هذا البروتوكول مواد شائعة توجد عادة في مختبرات زراعة الأنسجة. والنتيجة هي بديل أساسي ومتمايز وفعال من حيث التكلفة ل iPSCs وعيون المتبرعين البشريين وخلايا ARPE-19.
Introduction
ظهارة صبغة الشبكية (RPE) هي طبقة أحادية تقع في شبكية العين الخارجية بين غشاء بروخ والمستقبلات الضوئية1. تشكل خلايا RPE تقاطعات ضيقة مع بروتينات مثل zonula occludens-1 (ZO-1) وتمتلك نمطا ظاهريا مميزا يتميز بالتصبغ والتشكل السداسي 2,3. تساهم هذه الخلايا في الحاجز الدموي الشبكي ، وبالتالي تدعم صحة المستقبلات الضوئية وتحافظ على توازن الشبكية 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب خلايا RPE دورا مهما في الرؤية من خلال امتصاص الضوء وإعادة تدوير المكونات الأساسية للمستقبلات الضوئية6. على سبيل المثال ، RPE65 ، وهو بروتين يتم التعبير عنه بشكل كبير في خلايا RPE ، يحول استرات الريتينيل المتحولة بالكامل إلى 11-cisretinol 7,8. بالنظر إلى العديد من الوظائف التي تؤديها خلايا RPE ، فإن اختلالها الوظيفي متورط في أمراض مختلفة ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر واعتلال الشبكية السكري 9,10. لتعزيز فهم أمراض الشبكية وتطوير علاجات جديدة ، يتم استخدام نماذج في المختبر من شبكية العين بشكل متكرر.
لإنشاء نماذج تمثيلية لشبكية العين السليمة أو المريضة ، من الضروري استخدام نوع خلية RPE محاكاة. يفتقر خط خلايا ARPE-19 المتاح تجاريا إلى الأنماط الظاهرية الأصلية ، مثل التصبغ ، بينما قد تستغرق iPSCs شهورا للتمييزبين 11،12،13. على الرغم من أن عيون المتبرعين البشريين قد تكون مثالية ، إلا أنها غالبا ما تكون غير متاحة بسهولة للعديد من مختبرات الأبحاث.
هنا ، ابتكرنا طريقة لاستخدام عيون الخنازير ، التي تشترك في العديد من أوجه التشابه مع عيون الإنسان14 ، للحصول على خلايا RPE الأولية. تم استخدام خلايا RPE الخنازير الأولية هذه في نماذج شبكية متعددة15,16. هذه الخلايا ليست فعالة من حيث التكلفة فحسب ، بل إنها تتطلب أيضا وقتا أقل للحصول عليها من iPSCs أو عيون المتبرع. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تظهر خصائص أصلية ، مثل التصبغ والزغابات الدقيقة. في حين توجد بروتوكولات مماثلة لاستخراج RPE الخنازير17،18،19 ، فإن هذه التقنية المباشرة والمفصلة تؤكد صحة التفكك الأنزيمي وتستخدم المواد الموجودة عادة في معظم مختبرات زراعة الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم الحصول على العيون المستخدمة في هذا الإجراء بعد الوفاة من متجر جزارة محلي تم تفتيشه من قبل وزارة الزراعة الأمريكية ، ولا يتم تنفيذ أي عمل باستخدام الحية. بعد التضحية بالحيوانات ، يمر ما يقرب من 2 ساعة قبل استئصال العينين. نظرا لأن تسوس الأنسجة قد يبدأ في الحدوث ، فمن المهم الحفاظ على برودة العينين أثناء النقل لمنع المزيد من التسوس. في هذا الإجراء ، يتم وضع العينين على الفور في الثلاجة بعد الاستئصال. بعد ذلك ، يتم وضع كيس العيون داخل دورق من مادة البولي بروبيلين سعة 1000 مل ومحاط بالجليد داخل مبرد سعة 8 لتر. من المهم عدم وضع العينين مباشرة على الجليد. بمجرد وصول العينين إلى المختبر ، يتم عزل خلايا RPE داخل خزانة السلامة البيولوجية. من الأهمية بمكان إكمال هذه العملية في غضون 3-5 ساعات. تم تحسين هذا البروتوكول لمعالجة 10 عيون.
1. إعداد حصص مخزون DNase
ملاحظة: يوصى بتنفيذ هذه الخطوة قبل العزل.
- تحضير محلول كلوريد الكالسيوم 5 مللي متر مع الماء منزوع الأيونات المعقم.
تنبيه: يمكن أن يسبب مسحوق كلوريد الكالسيوم تهيجا شديدا للعين أو تلفا. ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة. - أضف محلول كلوريد الكالسيوم 5 مللي مول إلى مسحوق DNase (انظر جدول المواد) للحصول على تركيز DNase النهائي البالغ 3 مجم / مل. تأكد من خلط المحلول جيدا.
تنبيه: DNase هو خطر تحسس الجهاز التنفسي. لا تستنشق المسحوق / المادة. - أحجام صغيرة ، على سبيل المثال 1 مل ، في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
- تجمد القسمة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. إعداد منطقة التشريح
- نقل أدوات التشريح المعقمة ومعدات زراعة الخلايا إلى خزانة السلامة البيولوجية: الستارة الجراحية ، أطباق بتري ، مصافي الخلايا ، ألواح الآبار ، الشاش ، الملقط ، مقبض المشرط ، شفرة المشرط ، ومقص القزحية (انظر جدول المواد).
- باستخدام ملاقط ، وضع الستارة الجراحية. ضع طبقا واحدا من 6 آبار فوق الستارة الجراحية وقم بإزالة الغطاء.
- ضع حصة من محلول الفوسفات المخزن بالفوسفات المعقم من Dulbecco (DPBS) على الثلج وفي خزانة السلامة الحيوية.
- املأ بئرا واحدا من صفيحة مكونة من 6 آبار في منتصف الطريق ممتلئة (حوالي 6 مل) من محلول بوفيدون يود بنسبة 10٪.
- املأ الآبار المتبقية ب DPBS المبردة.
- قم بإزالة الغطاء من أحد أطباق بتري وضعه ، مقلوبا ، فوق الستارة الجراحية. ضع قاعدة طبق بتري جانبا كحاوية نفايات.
- ضع حصة من وسائط زراعة الخلايا (وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، 1٪ مضادات حيوية / مضادات فطرية) وحصة 0.25٪ تربسين / EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة محلول مخزون DNase من الفريزر (انظر بقية البروتوكول لمزيد من التفاصيل).
3. إزالة الأنسجة الخارجية
ملاحظة: يمكن إجراء إزالة الأنسجة الخارجية خارج خزانة السلامة البيولوجية. افحص العين قبل القطع للتأكد من عدم ثقب الصلبة ، وعدم ضبابية التلميذ ، ووجود العصب البصري. تجاهل العيون التي لا تستوفي هذه المعايير.
- أثناء إمساك العضلة المتصلة بالعين بيد واحدة ، استخدم اليد الأخرى لقطع الأنسجة المحيطة بالصلبة برفق بمشرط. احرص على عدم سحق العين أو قطع الصلبة عن طريق الخطأ. إذا تم قطع الصلبة وكشف الجزء الداخلي الأسود ، فتخلص من العين.
تنبيه: يوصى بشدة باستخدام قفاز مقاوم للقطع لليد التي تمسك العضلات للحماية من الجروح العرضية. - تقليم العصب البصري مع مقص القزحية المنحنية إلى طول لا يزيد عن 3 ملم. إذا كان العصب البصري طويلا جدا ، فلن يجلس كوب العين بشكل صحيح في مصفاة الخلية لاحقا.
- ضع العين على الثلج مع وضع القرنية لأسفل.
- كرر الخطوات من 3.1 إلى 3.3 حتى تتم إزالة الأنسجة الخارجية من كل عين.
4. تشريح العين
- استخدم الملقط لنقل العين إلى خزانة السلامة الحيوية وإلى البئر التي تحتوي على 10٪ من محلول البوفيدون واليود وقم بتدوير العين للتأكد من أنها مغلفة بالكامل بمحلول اليود. للحفاظ على الأدوات معقمة قدر الإمكان ، يجب استخدام هذه الملقط فقط للمس الجزء الخارجي من العين.
- بينما تجلس العين في محلول اليود ، ضع شاشا معقما على الغطاء الضحل المقلوب لطبق بتري الذي تم إعداده مسبقا. في طبق بتري منفصل ، ضع مصفاة خلية. استخدم مصفاة الخلايا فقط لدعم كوب العين ، وليس لفصل الخلايا.
- بعد السماح للعين بالجلوس في محلول اليود لمدة 30 ثانية تقريبا ، اغسل العين عن طريق غمسها في الآبار التي تحتوي على DPBS لمدة 5 ثوان تقريبا لكل منها ، والانتقال من بئر إلى بئر لتخفيف محلول اليود تدريجيا ، ونقل العين إلى الشاش المعقم.
- قم بعمل شق صغير باستخدام مشرط أسفل ora serrata ، أو ما يقرب من 1/3 أسفل الكرة الأرضية من حافة القزحية.
- بعد الشق ، استخدم مقص القزحية لقطع بالتساوي على طول محيط الكرة الأرضية ، بالتوازي مع القرنية. عند مناورة العين ، استخدم الملقط فقط للمس الجزء الخارجي من العين أو الشاش للحفاظ على العقم.
- استخدم الملقط للإمساك بالعصب البصري ورفع الكرة الأرضية برفق بعيدا عن الشاش. يجب أن يسقط الجسم الزجاجي من الكرة الأرضية. إذا لزم الأمر ، هز العين برفق للمساعدة في إزاحة الجسم الزجاجي.
ملاحظة: إذا كان من الصعب جدا إزالة الجسم الزجاجي ، فحاول قطعه لأسفل على الكرة الأرضية. - ضع كوب العين برفق في مصفاة الخلايا المعدة ، مع توجيه الجزء الداخلي من كوب العين لأعلى. إذا كان غير متساو ، استخدم الملقط لضبط كوب العين للحصول على شق مستو قدر الإمكان.
- أضف DPBS المبرد برفق إلى كوب العين بحيث يكون مستوى السائل أقل بقليل من أدنى نقطة في الشق. ستتم إزالة DPBS بعد إزالة الشبكية العصبية.
ملاحظة: سيختلف حجم DPBS المضاف حسب حجم العين وموقع الشق. - كرر الخطوات 4.1-4.8 حتى يتم تشريح جميع العيون.
5. إزالة الشبكية العصبية وتفكك RPE
ملاحظة: القسم التالي أسهل في التنفيذ على مراحل. في هذا الإعداد ، يتم تنفيذ هذه العملية على دفعة واحدة (عادة 3 أكواب للعين) في المرة الواحدة. بالنسبة للخطوات 5.1-5.7 ، يجب تنفيذ كل خطوة على الدفعة بأكملها قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- تحت مصباح يدوي ، ابحث عن أي مناطق تبدأ فيها شبكية العين العصبية (أبيض / وردي) في الانفصال عن RPE (أسود). بعد ذلك ، استخدم ملاقط حادة للإمساك بلطف على شبكية العين العصبية المرفوعة وتقشيرها بعيدا.
ملاحظة: إذا لم تكن هناك مناطق تنفصل فيها الشبكية العصبية ، فاستخدم الملقط للإمساك بها برفق بالقرب من الجزء العلوي من كوب العين. باستخدام هذه الطريقة ، إذا حدث تلف في RPE / choroid ، فلن يتم فصل هذه الخلايا أثناء تجميع RPE. - اجمع الشبكية العصبية برفق بالقرب من القرص البصري.
- نضح الشبكية العصبية باستخدام ماصة باستور متصلة بنظام شفط الفراغ. يوصى بريش الطموح للمساعدة في عملية الإزالة.
ملاحظة: يمكن وضع طرف ماصة في نهاية ماصة باستور لتقليل الشفط. - أضف بعناية DPBS مبرد إضافي لاستبدال ما تم استنشاقه.
- إزالة الشبكية العصبية المتبقية عن طريق الشفط مرة أخرى. هذه المرة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من DPBS مع عدم إزعاج RPE المكشوف.
- أضف التربسين برفق إلى كوب العين. حافظ على مستوى الصوت أسفل خط الشق وأي أقسام من RPE التالف لتقليل التلوث.
تنبيه: التربسين هو إنزيم يسبب تهيج الجلد والعين عند ملامسته. ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة. - بعد إضافة التربسين إلى كل عين ، تأكد من استبدال غطاء طبق بتري. بعد ذلك ، انقل طبق بتري إلى حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
- كرر الخطوات 5.1-5.7 لكل دفعة حتى تتم معالجة جميع أكواب العين.
6. جمع RPE
- اجمع خلايا RPE من كل دفعة من العيون (2-3 عيون) وضعها في أنبوب طرد مركزي واحد سعة 15 مل لجعل عملية البذر مباشرة.
- تحت مصباح يدوي ، قم بالسحن برفق باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لإزاحة خلايا RPE. إذا لم تنفصل خلايا RPE ، أضف التربسين الطازج واحتضانه لمدة 10-15 دقيقة إضافية. احرص على عدم كشط شبكية العين.
- اجمع خلايا RPE في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
- اغسل كوب العين بوسائط زراعة الخلايا لجمع أي خلايا متبقية وتحييد التربسين. تأكد من وجود ما لا يقل عن ضعف حجم الوسائط للتربسين في أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل.
- كرر الخطوة 6.1 حتى يتم جمع خلايا RPE من جميع أكواب العين.
- أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 250 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. تحضير محلول عمل DNase
- احسب حجم محلول مخزون DNase 3 مجم / مل (محضر في الخطوة 1) اللازم لإضافته إلى وسائط زراعة الخلايا لتركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل وحجم نهائي قدره 3 مل لكل أنبوب من الخلايا (أي بالنسبة لثلاثة أنابيب طرد مركزي من الخلايا ، يلزم 9 مل من محلول DNase 100 ميكروغرام / مل).
- الجمع بين الأحجام المناسبة من محلول مخزون DNase ووسائط زراعة الخلايا. يساعد استخدام DNase في محلول العمل على منع تكتل الخلايا ويسمح ببذر الخلايا بالتساوي.
8. بذر خلايا RPE
- بعد الطرد المركزي في الخطوة 6.3 ، قم بإزالة المواد الطافية من كل أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، مع الحرص على عدم تعطيل حبيبات الخلية.
- أعد تعليق كل حبيبة خلية في 3 مل من محلول عمل DNase.
- ضع أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مل التي تحتوي على الخلايا المعاد تعليقها في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 15 دقيقة.
- بعد الحضانة ، يقوم جهاز الطرد المركزي بتعليق الخلية عند 150 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة المواد الطافية, الحرص على عدم تعطيل الكريات الخلية.
- أعد تعليق كل حبيبة خلية في 3 مل من وسائط زراعة الخلايا الطازجة.
- لكل أنبوب طرد مركزي يحتوي على 2-3 عيون من خلايا RPE ، قم بزرع بئر واحد من لوحة 6 آبار (الممر 0).
- بعناية ، انقل الصفيحة المصنفة المكونة من 6 آبار إلى حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
9. ثقافة خلايا RPE الخنازير الأولية
- اسمح لخلايا RPE المصنفة حديثا بالتعلق لمدة 48-72 ساعة قبل تحريك اللوحة. أثناء تغيير الوسائط الأول ، يمكن إجراء غسل باستخدام وسائط زراعة الخلايا الطازجة للمساعدة في إزالة بقايا الخلايا الزائدة.
- استبدل وسائط زراعة الخلايا كل 48 ساعة.
- عندما تصل الخلايا إلى نقطة التقاء ، انتقل إلى وسط زراعة الخلايا بتركيز FBS بنسبة 2٪ واستمر حتى التجربة.
10. التحقق من صحة خلايا RPE
- تلطيخ كيميائي مناعي (ICC)
- ثبت الخلايا في 4٪ فورمالديهايد في DPBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل مرتين مع DPBS.
- تتخلل الخلايا (إذا لزم الأمر) باستخدام 0.2٪ Triton-X 100 في DPBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل مرتين مع DPBS.
- ضع محلول مانع بنسبة 3٪ (وزن / حجم) من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في DPBS لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- أضف الجسم المضاد الأساسي عند تخفيف 1: 100 (أو تركيز الشركة المصنعة الموصى به) (انظر جدول المواد) واتركه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- اغسل ثلاث مرات مع DPBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- أضف جسما مضادا ثانويا (إذا لزم الأمر) عند 2 ميكروغرام / مل (أو تركيز الشركة المصنعة الموصى به) (انظر جدول المواد) واتركه لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS لمدة 5 دقائق لكل منها إذا تم تطبيق الجسم المضاد الثانوي.
- أضف مسبار التلوين النووي بتركيز الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) واتركه لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- إذا كان على إدراج زراعة الخلية ، قم بالتركيب على شريحة المجهر باستخدام غطاء باستخدام وسيط التثبيت كما هو موضح بواسطة Rickabaugh و Weatherston et al.20. خلاف ذلك ، خلايا الصورة في DPBS.
- المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)
- اتبع الإجراء الذي حدده Harris et al.21.
- المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER)
- اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لقياس TEER (انظر جدول المواد) مع 1 مل من وسط الاستزراع في الغرفة القاعدية15.
- مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)
- قم بإجراء ELISA15 باستخدام مجموعة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم البشري المتعدد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا الإجراء ، تم عزل خلايا RPE الأولية بنجاح من عيون الخنازير. يوضح الشكل 1 أ خلايا RPE بعد 3 أيام من العزلة مع تصبغ مميز. بعد أسبوع واحد من النمو ، كانت الخلايا متقاربة تماما وشكلت طبقة أحادية صحية (الشكل 1 ب). ثم تم نقل الخلايا إلى حشوات زراعة الخلايا حيث حافظت على تصبغها ومورفولوجيتها (الشكل 1C) ، مما يدعم فعالية إجراء العزل. الثقافات التي لم تظهر هذه الخصائص وبدلا من ذلك أظهرت مورفولوجيا متغيرة وتصبغ مفرط (الشكل 1 د) يشتبه في تلوثها الخلوي ولم تستخدم في التجارب. تعبر خلايا RPE المعزولة في هذه المخطوطة عن RPE65 ، وهو بروتين يتم التعبير عنه بشكل كبير في خلايا RPE (الشكل 2). من المحتمل أن تكون المناطق التي يظهر فيها تعبير RPE65 أقل بسبب التصبغ الذي يحجب التألق ، حيث تتوافق تلك المناطق مع الخلايا المصطبغة بشكل أكبر (الشكل 2 أ). بروتين مميز آخر عبرت عنه خلايا RPE المعزولة كان VEGF. بعد 10 أيام ، تم التعبير عن VEGF أكثر على الجانب القاعدي من الطبقة الأحادية RPE بتركيز 2612.5 ± 28.0 بيكوغرام / مل مقارنة بالجانب القمي بتركيز 2141.2 ± 53.5 بيكوغرام / مل (الشكل 3). تحتوي خلايا RPE الخنازير الأولية أيضا على مورفولوجيا الزغابات الدقيقة والحصاة (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، عندما نمت على إدخالات زراعة الخلايا ، زادت قراءات TEER من 166.1 ± 75.9 Ω∙cm2 في 7 أيام إلى 363.4 ± 9.0 Ω∙cm2 بعد 14 يوما (الشكل 5) ، مما يشير إلى تكوين تقاطع ضيق ثابت وصحي بمرور الوقت22. لمزيد من التحقيق في تكوين الوصلة ، تم تحليل خلايا RPE لتعبير ZO-1 ، والذي تم توطينه في حدود الخلايا ، مما يعني تكوين تقاطع صحي وسلامة أحادية الطبقة (الشكل 6).
الشكل 1: RPE الأساسي بعد بذره على ألواح البئر وزراعته الفرعية. خلايا RPE السليمة بعد 3 أيام من العزل (A) ، أحادية الطبقة المتقاربة بالكامل بعد 7 أيام من العزل (B) ، تم تمرير RPE بنجاح إلى إدراج مزرعة (C) ، ومناطق التلوث الخلوي المحتمل (الأسهم) على ثقافة RPE (D). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: صور كيميائية مناعية تظهر تعبير RPE65 في خلايا RPE الخنازير. صور برايتفيلد (A) و RPE65 (B) والنوى (C) وصور مدمجة (D) للخلايا بعد 15 يوما من البذر. لاحظ أن الخلفية المحببة في صورة برايتفيلد هي غشاء إدراج الثقافة المسامية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تعبير VEGF في الجوانب القمية والقاعدية للطبقة الأحادية RPE. تم تحديد تركيز VEGF بواسطة ELISA الذي تم إجراؤه بعد 10 أيام من نمو الخلايا على إدخالات الثقافة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري مع n = 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صورة المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لخلايا RPE الخنازير الأولية. نمت الخلايا لمدة 30 يوما قبل التصوير. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: قراءات TEER التي أجريت على خلايا RPE المزروعة على إدخالات زراعة الخلايا. قيم المقاومة بعد 7 و 10 و 14 يوما من النمو. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري مع n = 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صور كيميائية مناعية تظهر تعبير ZO-1 في خلايا RPE الخنازير. برايتفيلد (A) ZO-1 (B) ، نوى (C) ، وصور مدمجة (D) للخلايا بعد 6 أيام من البذر على ألواح الآبار الزجاجية السفلية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول كيفية عزل خلايا RPE عن عيون الخنازير. يظهر التصبغ ومورفولوجيا الحصى في غضون 7 أيام من العزلة (الشكل 1 ب). علاوة على ذلك ، تشير بيانات TEER إلى تكوين تقاطع ضيق22 وطبقة أحادية صحية (الشكل 5). تظهر هذه النتائج أن خلايا RPE المعزولة بهذه الطريقة تشبه RPE البشري ويمكن أن تكون مفيدة في نماذج زراعة خلايا الشبكية.
يتم الحصول على العيون المستخدمة في هذه المخطوطة بعد الوفاة من متجر جزارة محلي ، ولكن يمكن أيضا الحصول عليها من مصادر أخرى ، مثل الإعدادات الأكاديمية مع المتعاونين الذين يستخدمون منتجات الخنازير. من المهم أن تبدأ الإجراء في أقرب وقت ممكن بعد موت وأن تبقي العينين باردتين قبل الإجراء. أثناء العزلة ، من الضروري عدم تعطيل RPE حتى الثقب بعد التربسين. هذه الرعاية هي الأكثر أهمية عند تقشير الشبكية العصبية ، لأن عدم الحذر قد يؤدي إلى الاستيلاء على غشاء Bruch1 مع الملقط وإدخال أنواع أخرى من الخلايا في المحلول.
بينما تم تحسين هذا الإجراء لظروفنا ، يمكن إجراء بعض التغييرات على المنهجية. على سبيل المثال ، إذا كانت هناك رغبة في كثافات بذر محددة ، فيمكن حساب الخلايا بعد حضانة DNase. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان الشفط الفراغي لا يعمل ، فيمكن إزالة شبكية العين العصبية عن طريق التشذيب بعناية باستخدام مقص صغير منحني. عند البذر للتجارب ، يمكن استخدام كثافة بذر عالية مثل 2.5 × 105 خلايا / سم2 لمنع الانقسام الخلوي الزائد. علاوة على ذلك ، لا ينصح بالمرور المتكرر لأن الخلايا يمكن أن تبدأ في فقدان أنماطها الظاهرية الأصلية. بينما استخدمت هذه الدراسة خلايا الممر 1 للتجارب ، يمكن استخدام مقاطع إضافية إذا تم الحفاظ على النمط الظاهري RPE والخصائص. أخيرا ، يمكن استخدام تركيز 1٪ FBS للثقافة الفرعية أو التجريب بدلا من 2٪ ، إذا رغبت في ذلك.
هناك بعض العيوب لهذه الطريقة. أولا ، من الصعب تكرار أو الحصول على عمر والجنس والسلالة ووقت الوفاة ، وهي مشاكل شائعة في عزل الخلايا الأولية. ثانيا ، يمكن أن يؤدي الإفراط في التربسين بسرعة إلى خلايا غير طبيعية ، وهو ما لاحظه أيضا Fietz etal 17. ومع ذلك ، في النهاية ، توفر هذه الطريقة طريقة غير مكلفة وفعالة للحصول على خلايا RPE الأولية. لا تتطلب هذه الخلايا أوقات تمايز طويلة مثل iPSCs. تحتوي RPE الخنازير هذه أيضا بالفطرة على هياكل رئيسية ، مثل الزغابات الدقيقة والتصبغ15,16 ، على عكس نظيراتها غير المتمايزة. على هذا النحو ، تقدم هذه الخلايا نوعا أكثر تمثيلا من الخلايا لدراسات الشبكية. أخيرا ، يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة جدا للمناطق الريفية أو المؤسسات التي لا تستطيع الوصول إلى عيون المتبرعين البشريين لإنتاج نماذج شبكية مماثلة للنماذج البشرية لفهم الرؤية والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا فرهاد فرجود على المساعدة في زراعة خلايا RPE الخنازير والعزلة وتوماس هاريس للمساعدة في SEM. يقر المؤلفون بالدعم المقدم من مرفق الفحص المجهري الأساسي في جامعة ولاية يوتا لتحليل SEM. يحتفظ المرفق بمجهر إلكتروني ماسح تم الحصول عليه من خلال منحة أجهزة البحث الرئيسية لمؤسسة العلوم الوطنية (CMMI-1337932). تم توفير التمويل لهذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة من خلال المنحة 1R15EY028732 (فارغيس) ومنحة مؤسسة برايت فوكس M2019109 (فارغيس). تم توفير تمويل إضافي من خلال منحة البحث والفرص الإبداعية للطلاب الجامعيين (Weatherston) من مكتب الأبحاث بجامعة ولاية يوتا ومنحة أولية (Vargis) من مركز أبحاث مرض الزهايمر والخرف بجامعة ولاية يوتا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S.
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Paterson, C., Cannon, J., Vargis, E. The impact of early RPE cell junction loss on VEGF, Ang-2, and TIMP secretion in vitro. , http://www.molvis.org/molvis/v29/87/ (2023).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
