Summary
Este protocolo describe el procedimiento para obtener y cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina (EPR) a partir de ojos porcinos de origen local. Estas células sirven como una alternativa de alta calidad a las células madre y son adecuadas para la investigación in vitro de la retina.
Abstract
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa crucial en la retina externa responsable de soportar los fotorreceptores. La degeneración del EPR ocurre comúnmente en enfermedades marcadas por la pérdida progresiva de la visión, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). La investigación sobre la DMAE a menudo se basa en ojos de donantes humanos o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para representar el EPR. Sin embargo, estas fuentes de EPR requieren períodos de diferenciación prolongados y una experiencia sustancial para el cultivo. Además, algunas instituciones de investigación, en particular las de las zonas rurales, carecen de fácil acceso a los ojos de los donantes. Si bien existe una línea celular de EPR inmortalizada disponible comercialmente (ARPE-19), carece de características esenciales de EPR in vivo y no es ampliamente aceptada en muchas publicaciones de investigación oftalmológica. Existe una necesidad apremiante de obtener células primarias representativas del EPR de una fuente más fácilmente disponible y rentable. Este protocolo dilucida el aislamiento y subcultivo de células primarias de EPR obtenidas post-mortem de ojos porcinos, que pueden obtenerse localmente de proveedores comerciales o académicos. Este protocolo requiere materiales comunes que normalmente se encuentran en los laboratorios de cultivo de tejidos. El resultado es una alternativa primaria, diferenciada y rentable a las iPSC, los ojos de donantes humanos y las células ARPE-19.
Introduction
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa situada en la retina externa entre la membrana de Bruch y los fotorreceptores1. Las células del EPR forman uniones estrechas con proteínas como la zonula occludens-1 (ZO-1) y poseen un fenotipo distintivo caracterizado por pigmentación y morfología hexagonal 2,3. Estas células contribuyen a la barrera hematorretiniana, apoyando así la salud de los fotorreceptores y manteniendo la homeostasis de la retina 4,5. Además, las células del EPR desempeñan un papel fundamental en la visión al absorber la luz y reciclar componentes esenciales para los fotorreceptores6. Por ejemplo, RPE65, una proteína altamente expresada en las células EPR, convierte los ésteres de retinol trans en retinol 11-cis 7,8. Dada la multitud de funciones que realizan las células EPR, su disfunción está implicada en diversas enfermedades, como la degeneración macular asociada a la edad y la retinopatía diabética 9,10. Para mejorar la comprensión de las patologías de la retina y desarrollar nuevos tratamientos, se emplean con frecuencia modelos in vitro de la retina.
Para generar modelos representativos de retinas sanas o enfermas, es imprescindible utilizar un tipo de célula mimética del EPR. La línea celular ARPE-19 disponible comercialmente carece de fenotipos nativos, como la pigmentación, mientras que las iPSC pueden tardar meses en diferenciarse 11,12,13. Aunque los ojos de donantes humanos pueden ser ideales, a menudo no están disponibles para muchos laboratorios de investigación.
Aquí, hemos ideado un método para utilizar ojos porcinos, que comparten muchas similitudes con los ojos humanos14, para obtener células primarias del EPR. Estas células primarias del EPR porcino se han utilizado en múltiples modelos de retina15,16. Estas células no solo son rentables, sino que también requieren menos tiempo para adquirirse que las iPSC o los ojos de donante. Además, exhiben características nativas, como pigmentación y microvellosidades. Si bien existen protocolos similares para la extracción de EPR porcino 17,18,19, esta técnica sencilla y detallada valida aún más la disociación enzimática y emplea materiales que se encuentran comúnmente en la mayoría de los laboratorios de cultivos celulares.
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Protocol
Los ojos utilizados en este procedimiento se obtienen post mortem de una carnicería local inspeccionada por el USDA, y no se realiza ningún trabajo con animales vivos. Después de que los animales han sido sacrificados, pasan aproximadamente 2 horas antes de que los ojos sean enucleados. Dado que puede comenzar a producirse una caries en los tejidos, es importante mantener los ojos fríos durante el transporte para evitar más caries. En este procedimiento, los ojos se colocan inmediatamente en un refrigerador después de la enucleación. Posteriormente, la bolsa de ojos se coloca dentro de un vaso de polipropileno de 1000 mL y se rodea de hielo dentro de un enfriador de 8 L. Es importante no colocar los ojos directamente sobre el hielo. Una vez que los ojos llegan al laboratorio, el aislamiento de las células del EPR se realiza dentro de una cabina de bioseguridad. Es crucial completar este proceso en un plazo de 3 a 5 horas. Este protocolo ha sido optimizado para procesar 10 ojos.
1. Preparación de las alícuotas de las existencias de DNasa
NOTA: Se recomienda que este paso se realice antes del aislamiento.
- Prepare una solución de cloruro de calcio de 5 mM con agua desionizada estéril.
PRECAUCIÓN: El cloruro de calcio en polvo puede causar irritación o daño ocular grave. Use el equipo de protección personal adecuado. - Agregue 5 mM de solución de cloruro de calcio al polvo de DNasa (ver Tabla de Materiales) para obtener una concentración final de DNasa de 3 mg/mL. Asegúrese de que la solución esté bien mezclada.
PRECAUCIÓN: La DNasa es un peligro para la sensibilización respiratoria. No inhale polvo/sustancia. - Alícuota de pequeños volúmenes, por ejemplo 1 mL, en tubos de microcentrífuga.
- Congelar las alícuotas a -20 °C hasta su uso.
2. Configuración del área de disección
- Transfiera los instrumentos de disección estériles y el equipo de cultivo celular al gabinete de bioseguridad: paño quirúrgico, placas de Petri, filtros de células, placas de pocillos, gasas, pinzas, mango de bisturí, hoja de bisturí y tijeras de iris (consulte la Tabla de materiales).
- Con unas pinzas, coloque el paño quirúrgico. Coloque una placa de 6 pocillos sobre el paño quirúrgico y retire la tapa.
- Coloque una alícuota de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) estéril de Dulbecco sobre hielo y en el gabinete de bioseguridad.
- Llene un pocillo de un plato de 6 pocillos hasta la mitad (aproximadamente 6 ml) de solución de povidona yodada al 10%.
- Llene los pocillos restantes con DPBS refrigerado.
- Retire la tapa de una de las placas de Petri y colóquela, invertida, sobre el paño quirúrgico. Reserve la base de la placa de Petri como contenedor de residuos.
- Colocar una alícuota de medios de cultivo celular (medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino (FBS) al 10%, antibióticos/antimicóticos al 1%) y una alícuota de tripsina/EDTA al 0,25% en un baño de agua a 37 °C.
- Retire la solución madre de DNasa del congelador (consulte el resto del protocolo para obtener más detalles).
3. Extirpación del tejido exterior
NOTA: La extracción de tejido exterior se puede realizar fuera de la cabina de bioseguridad. Inspeccione el ojo antes de cortar para asegurarse de que la esclerótica no haya sido perforada, que la pupila no esté nublada y que el nervio óptico esté presente. Deseche los ojos que no cumplan con estos criterios.
- Mientras sostiene el músculo unido al ojo con una mano, use la otra mano para cortar suavemente el tejido que rodea la esclerótica con un bisturí. Tenga cuidado de no aplastar el ojo o cortar accidentalmente la esclerótica. Si la esclerótica está cortada y expone el interior negro, deseche el ojo.
PRECAUCIÓN: Se recomienda encarecidamente un guante resistente a los cortes para la mano que sostiene el músculo para protegerlo contra cortes accidentales. - Recorte el nervio óptico con unas tijeras de iris curvo a una longitud no superior a 3 mm. Si el nervio óptico es demasiado largo, la copa del ojo no se asentará correctamente en el filtro celular más adelante.
- Coloque el ojo sobre hielo con la córnea hacia abajo.
- Repita los pasos 3.1-3.3 hasta que se extraiga el tejido exterior de cada ojo.
4. Disección ocular
- Use pinzas para transferir un ojo al gabinete de bioseguridad y al pocillo que contiene una solución de povidona yodada al 10% y gire el ojo para asegurarse de que esté completamente cubierto con la solución de yodo. Para mantener las herramientas lo más estériles posible, estas pinzas solo deben usarse para tocar el exterior del ojo.
- Mientras el ojo está en una solución de yodo, coloque una gasa estéril en la tapa invertida poco profunda de la placa de Petri preparada anteriormente. En una placa de Petri aparte, coloque un colador de células. Utilice únicamente el colador de células para sostener la copa del ojo, no para la separación de células.
- Después de dejar reposar el ojo en una solución de yodo durante aproximadamente 30 s, lávese el ojo sumergiéndolo en los pocillos que contienen DPBS durante aproximadamente 5 s cada uno, moviéndose de pocillo en pocillo para diluir progresivamente la solución de yodo y transfiera el ojo a la gasa estéril.
- Haz una pequeña incisión con un bisturí debajo de la ora serrata, o aproximadamente 1/3 del globo desde el borde del iris.
- Después de la incisión, use unas tijeras de iris para cortar uniformemente a lo largo de la circunferencia del globo, paralelo a la córnea. Al maniobrar el ojo, solo use las pinzas para tocar la parte exterior del ojo o la gasa para mantener la esterilidad.
- Use las pinzas para agarrar el nervio óptico y levante suavemente el globo de la gasa. El vítreo debe caerse del globo. Si es necesario, agite suavemente el ojo para ayudar a desalojar el vítreo.
NOTA: Si el vítreo es muy difícil de eliminar, intente cortar más abajo en el globo. - Coloque suavemente el ocular en el colador de células preparado, con el interior del ocular hacia arriba. Si es desigual, use pinzas para ajustar el ocular para que la incisión quede lo más nivelada posible.
- Agregue suavemente DPBS enfriado a la copa del ojo para que el nivel de líquido esté justo por debajo del punto más bajo de la incisión. Este DPBS se extirpará después de la extirpación de la retina neural.
NOTA: El volumen de DPBS agregado variará según el tamaño del ojo y la ubicación de la incisión. - Repita los pasos 4.1-4.8 hasta que se disecen todos los ojos.
5. Extirpación de retina neural y disociación del EPR
NOTA: La siguiente sección es más fácil de realizar por etapas. En esta configuración, este proceso se realiza en un lote (generalmente 3 copas oculares) a la vez. Para los pasos 5.1-5.7, cada paso debe realizarse en todo el lote antes de pasar al siguiente paso.
- Debajo de una linterna, busque cualquier área donde la retina neural (blanca/rosa) esté comenzando a desprenderse del EPR (negro). Luego, use pinzas romas para agarrar suavemente la retina neural levantada y despegarla.
NOTA: Si no hay áreas donde la retina neural se esté desprendiendo, use las pinzas para agarrarla suavemente cerca de la parte superior de la copa del ojo. Con este método, si se produce daño en el EPR/coroides, esas células no se disociarán durante la recolección del EPR. - Recoja suavemente la retina neural cerca del disco óptico.
- Aspire la retina neural con una pipeta Pasteur conectada a un sistema de aspiración endouterina. Se recomienda difuminar la aspiración para ayudar en el proceso de eliminación.
NOTA: Se puede colocar una punta de pipeta en el extremo de una pipeta Pasteur para reducir la succión. - Agregue con cuidado DPBS refrigerados adicionales para reemplazar lo que se aspiró.
- Retire la retina neural restante aspirando una vez más. Esta vez, elimine la mayor cantidad posible de DPBS sin alterar el EPR expuesto.
- Agregue suavemente tripsina a la copa del ojo. Mantenga el nivel de volumen por debajo de la línea de incisión y de cualquier sección de EPR dañado para reducir la contaminación.
PRECAUCIÓN: La tripsina es una enzima que causará irritación de la piel y los ojos al contacto. Use el equipo de protección personal adecuado. - Después de agregar tripsina a cada ojo, asegúrese de reemplazar la tapa de la placa de Petri. A continuación, transfiera la placa de Petri a una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 min.
- Repita los pasos 5.1 a 5.7 para cada lote hasta que se hayan procesado todas las copas oculares.
6. Recogida de RPE
- Recoja las células del EPR de cada lote de ojos (2-3 ojos) y colóquelas en un solo tubo de centrífuga de 15 ml para facilitar el proceso de siembra.
- Bajo una linterna, triture suavemente con una pipeta de 1000 μL para desalojar las células del EPR. Si las células del EPR no se desprenden, agregue tripsina fresca e incube durante 10-15 minutos más. Tenga cuidado de no raspar la retina.
- Recoja las células del EPR en un tubo de centrífuga de 15 ml.
- Lave la copa ocular con medios de cultivo celular para recolectar las células restantes y neutralizar la tripsina. Asegúrese de que haya al menos el doble de volumen de medios para tripsina en el tubo de centrífuga de 15 ml.
- Repita el paso 6.1 hasta que se hayan recolectado células del EPR de todas las copas oculares.
- Centrifugar las suspensiones celulares a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
7. Preparación de la solución de trabajo de DNase
- Calcule el volumen de 3 mg/ml de solución madre de DNasa (preparada en el paso 1) necesario para añadir a los medios de cultivo celular para obtener una concentración final de 100 μg/ml y un volumen final de 3 ml por tubo de células (es decir, para tres tubos centrífugos de células, se requieren 9 ml de solución de DNasa de 100 μg/ml).
- Combine los volúmenes apropiados de solución madre de DNasa y medios de cultivo celular. El uso de DNasa en la solución de trabajo ayuda a prevenir la aglomeración celular y permite que las células se siembren de manera uniforme.
8. Siembra de células EPR
- Después de la centrifugación en el paso 6.3, retire los sobrenadantes de cada tubo de centrífuga de 15 ml, con cuidado de no romper el gránulo celular.
- Vuelva a suspender cada gránulo celular en 3 ml de solución de trabajo de DNasa.
- Colocar los tubos de centrífuga de 15 mL que contienen las células resuspendidas en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 15 min.
- Después de la incubación, centrifugar las suspensiones celulares a 150 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retire los sobrenadantes, con cuidado de no alterar los gránulos de la celda.
- Vuelva a suspender cada gránulo celular en 3 ml de medio de cultivo celular fresco.
- Para cada tubo de centrífuga que contenga 2-3 ojos de células EPR, siembre un pocillo de una placa de 6 pocillos (pasaje 0).
- Con cuidado, transfiera la placa de 6 pocillos sembrada a una incubadora humidificada a 37 °C y 5% deCO2.
9. Cultivo primario de células EPR porcinas
- Deje que las células del EPR recién sembradas se adhieran durante 48-72 h antes de mover la placa. Durante el primer cambio de medio, se puede realizar un lavado con medios de cultivo celular nuevos para ayudar a eliminar el exceso de restos celulares.
- Reemplace el medio de cultivo celular cada 48 h.
- Cuando las células alcancen la confluencia, se debe hacer la transición a un medio de cultivo celular con una concentración de FBS del 2% y mantener hasta la experimentación.
10. Validación de la célula RPE
- Tinción inmunocitoquímica (ICC)
- Fije las celdas en formaldehído al 4% en DPBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar dos veces con DPBS.
- Permeabilice las células (si es necesario) con Triton-X 100 al 0,2 % en DPBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar dos veces con DPBS.
- Aplique una solución de bloqueo de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% (p/v) en DPBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Añadir el anticuerpo primario a una dilución de 1:100 (o a la concentración recomendada por el fabricante) (ver Tabla de materiales) y dejar reposar durante 1 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C.
- Lavar tres veces con DPBS durante 5 minutos cada una.
- Agregue el anticuerpo secundario (si es necesario) a 2 μg/ml (o la concentración recomendada por el fabricante) (consulte la Tabla de materiales) y deje reposar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar tres veces con DPBS durante 5 minutos cada una si se aplica un anticuerpo secundario.
- Agregue la sonda de tinción nuclear a la concentración del fabricante (consulte la Tabla de materiales) y déjela reposar durante 25 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar tres veces con PBS durante 5 minutos cada una.
- Si se encuentra en un inserto de cultivo celular, móntelo en el portaobjetos del microscopio con un cubreobjetos utilizando el medio de montaje descrito por Rickabaugh y Weatherston et al.20. De lo contrario, las celdas de imagen en DPBS.
- Microscopía electrónica de barrido (SEM)
- Seguir el procedimiento descrito por Harris et al.21.
- Resistencia eléctrica transepitelial (TEER)
- Siga el protocolo del fabricante para la medición de TEER (ver Tabla de Materiales) con 1 mL de medio de cultivo en la cámara basal15.
- Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
- Realice ELISA15 utilizando un kit de ensayo de inmunoabsorción enzimática humana múltiple siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la tabla de materiales).
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Representative Results
Con este procedimiento, las células primarias del EPR se aislaron con éxito de los ojos porcinos. La Figura 1A muestra las células del EPR 3 días después del aislamiento con pigmentación característica. Después de 1 semana de crecimiento, las células fueron completamente confluentes y formaron una monocapa sana (Figura 1B). A continuación, las células se transfirieron a insertos de cultivo celular donde mantuvieron su pigmentación y morfología (Figura 1C), lo que respalda aún más la eficacia del procedimiento de aislamiento. Los cultivos que no exhibieron estas características y en su lugar mostraron una morfología variante y una pigmentación excesiva (Figura 1D) se sospecharon de contaminación celular y no se utilizaron en experimentos. Las células EPR aisladas en este manuscrito expresan RPE65, una proteína altamente expresada en las células EPR (Figura 2). Las áreas donde la expresión de RPE65 parece más baja probablemente se deban a que la pigmentación bloquea la fluorescencia, ya que esas áreas corresponden a células más pigmentadas (Figura 2A). Otra proteína característica expresada por las células EPR aisladas fue el VEGF. Después de 10 días, el VEGF se expresó más en el lado basal de la monocapa de EPR con una concentración de 2612.5 ± 28.0 pg/mL en comparación con el lado apical con una concentración de 2141.2 ± 53.5 pg/mL (Figura 3). Las células primarias del EPR porcino también tienen morfología de microvellosidades y adoquines (Figura 4). Además, cuando se cultivaron en insertos de cultivo celular, las lecturas de TEER aumentaron de 166,1 ± 75,9 Ω∙cm2 a los 7 días a 363,4 ± 9,0 Ω∙cm2 después de 14 días (Figura 5), lo que indica una formación de uniones estrechas consistentes y saludables a lo largo del tiempo22. Para investigar más a fondo la formación de uniones, se analizaron las células EPR para determinar la expresión de ZO-1, que se localizó en los límites celulares, lo que implica la formación de uniones sanas y la integridad de la monocapa (Figura 6).
Figura 1: EPR primario después de ser sembrado en placas de pocillos y subcultivado. Células sanas del EPR 3 días después del aislamiento (A), monocapa completamente confluente 7 días después del aislamiento (B), EPR pasado con éxito a un inserto de cultivo (C) y áreas de contaminación celular potencial (flechas) en un cultivo de EPR (D). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes inmunocitoquímicas que muestran la expresión de RPE65 en células de EPR porcinas. Imágenes de campo claro (A), RPE65 (B), núcleos (C) y fusionadas (D) de células 15 días después de la siembra. Tenga en cuenta que el fondo granulado en la imagen de campo claro es la membrana porosa del inserto de cultivo. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Expresión de VEGF en los lados apical y basal de la monocapa de EPR. La concentración de VEGF se determinó mediante un ELISA realizado después de 10 días de crecimiento celular en insertos de cultivo. Las barras de error representan la desviación estándar con n = 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imagen de microscopía electrónica de barrido (SEM) de células primarias de EPR porcinas. Las células se cultivaron durante 30 días antes de la obtención de imágenes. Barra de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Lecturas de TEER realizadas en células de EPR cultivadas en insertos de cultivo celular. Valores de resistencia después de 7, 10 y 14 días de crecimiento. Las barras de error representan la desviación estándar con n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes inmunocitoquímicas que muestran la expresión de ZO-1 en células porcinas del EPR. Imágenes de campo claro (A), ZO-1 (B), núcleos (C) e imágenes fusionadas (D) de células 6 días después de la siembra en placas de pocillos con fondo de vidrio. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe cómo aislar las células del EPR de los ojos porcinos. La pigmentación y la morfología de los adoquines se observan a los 7 días del aislamiento (Figura 1B). Además, los datos de TEER indican la formación de uniones estrechas22 y una monocapa saludable (Figura 5). Estos resultados muestran que las células de EPR aisladas con este método son similares a las EPR humanas y pueden ser beneficiosas en modelos de cultivo de células de retina.
Los ojos utilizados en este manuscrito se obtuvieron post mortem de una carnicería local, pero también podrían obtenerse de otras fuentes, como entornos académicos con colaboradores que utilizan productos porcinos. Es importante comenzar el procedimiento tan pronto como sea posible después de la muerte del animal y mantener los ojos fríos antes del procedimiento. Durante el aislamiento, es esencial no alterar el EPR hasta la trituración después de la tripsinización. Este cuidado es más crítico cuando se despega la retina neural, ya que la falta de precaución puede llevar a agarrar la membrana de Bruch1 con las pinzas e introducir otros tipos de células en la solución.
Si bien este procedimiento se ha optimizado para nuestras condiciones, se pueden realizar algunos cambios en la metodología. Por ejemplo, si se desean densidades de siembra específicas, las células se pueden contar después de la incubación de la DNasa. Además, si la aspiración endouterina no funciona, la retina neural se puede extirpar recortándola cuidadosamente con unas tijeras pequeñas y curvas. Al sembrar para experimentos, se puede utilizar una alta densidad de siembra, como 2,5 x 105 células/cm2 , para evitar el exceso de división celular. Además, no se recomienda el paso repetido, ya que las células pueden comenzar a perder sus fenotipos nativos. Si bien este estudio ha utilizado células de pasaje 1 para experimentos, se podrían usar pasajes adicionales si se mantienen el fenotipo y las características del EPR. Por último, se puede utilizar una concentración de 1% de FBS para subcultivo o experimentación en lugar de 2%, si se desea.
Este método tiene algunos inconvenientes. En primer lugar, es difícil replicar u obtener la edad, el sexo, la raza y el momento de la muerte de los animales, que son problemas comunes en el aislamiento celular primario. En segundo lugar, la tripsinización excesiva puede dar lugar rápidamente a células anormales, lo que también ha sido observado por Fietz et al17. Sin embargo, en última instancia, este método ofrece una forma económica y eficiente de obtener células primarias del EPR. Estas células no requieren largos tiempos de diferenciación como las iPSC. Estos EPR porcinos también tienen estructuras clave de forma innata, como las microvellosidades y la pigmentación15,16, a diferencia de sus homólogos no diferenciados. Como tales, estas células ofrecen un tipo de célula más representativo para los estudios de retina. Por último, este método podría ser muy beneficioso para las zonas más rurales o las instituciones que no tienen acceso a los ojos de donantes humanos para producir modelos de retina análogos a los modelos humanos para comprender la visión y la enfermedad.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Farhad Farjood por su ayuda con el cultivo y aislamiento de células de EPR porcino y a Thomas Harris por su ayuda con SEM. Los autores agradecen el apoyo de la Instalación Central de Microscopía de la Universidad Estatal de Utah para el análisis SEM. La instalación mantiene un microscopio electrónico de barrido adquirido a través de una subvención de instrumentación de investigación principal de la Fundación Nacional de Ciencias (CMMI-1337932). La financiación de este estudio fue proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud a través de la subvención 1R15EY028732 (Vargis) y una subvención de la Fundación BrightFocus M2019109 (Vargis). Se proporcionaron fondos adicionales mediante una beca de investigación de pregrado y oportunidades creativas (Weatherston) de la Oficina de Investigación de la Universidad Estatal de Utah y una subvención inicial (Vargis) del Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer y la Demencia de la Universidad Estatal de Utah.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified - calcium - magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
References
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch's membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S.
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Paterson, C., Cannon, J., Vargis, E. The impact of early RPE cell junction loss on VEGF, Ang-2, and TIMP secretion in vitro. , http://www.molvis.org/molvis/v29/87/ (2023).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch's membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch's membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
