One-step Metabolomica: carboidrati, acidi organici e aminoacidi quantificati in una procedura unica

Summary

Il metodo ureasi di preparazione dei campioni per GC / MS dei metaboliti di intermediazione è presentato dal suo inventore. Il metodo permette di one-step di follow-up di screening neonatale per errori congeniti mediante spettrometria di massa tandem dai carboidrati quantificazione, organici e aminoacidi tutti in un unico processo.

Abstract

Ogni bambino nato negli Stati Uniti è ora proiettato fino a 42 malattie rare genetiche chiamate "errori congeniti del metabolismo". Il metodo di screening si basa sulla spettrometria di massa tandem e quantifica acilcarnitine come schermo per acidemias organici e misure anche aminoacidi. Tutti gli stati anche eseguire il test enzimatico per i disturbi di carboidrati come la galattosemia. Perché i risultati possono essere non specifici, test di follow-up dei risultati positivi è necessario utilizzare un metodo più definitiva. La presente relazione descrive il metodo "ureasi" di preparazione dei campioni per lo screening errore congenito. Enzima ureasi cristallino è utilizzato per rimuovere l'urea da fluidi corporei che permette maggior parte degli altri metaboliti solubili in acqua da disidratare e derivatizzati per gascromatografia in un unico procedimento. Disidratazione per evaporazione in corrente di azoto è facilitato con l'aggiunta di acetonitrile e cloruro di metilene. Poi, trimethylsilylation avviene in presenza di un unico catalizzatore, trifluoroacetato triethylammonium. Iniezione automatizzato e cromatografia è seguito da macro-driven quantificazione usanza di 192 metaboliti e semi-quantificazione di ogni componente principale utilizzando librerie specializzate di spettri di massa di TMS derivatizzati composti biologici. L'analisi può essere eseguita sul ampiamente utilizzato piattaforma Chemstation utilizzando le macro e librerie disponibili da parte dell'autore. Nel nostro laboratorio, oltre 16.000 campioni di pazienti sono stati analizzati utilizzando il metodo con una resa diagnostica di circa il 17% – vale a dire il 17% dei campioni risultati rivelano che i risultati dovrebbero essere attuate da parte del medico di ordinazione. Inclusi in queste oltre 180 sono gli errori confermata congeniti, di cui circa il 38% non avrebbe potuto essere diagnosticata con metodi precedenti.

Protocol

Procedura per l'elaborazione campioni di urina Scongelare il campione di urina in un bagno d'acqua a 37 ° C. Decantare in un nuovo contenitore se l'originale è compromessa. Prendete un aliquota massima di 13 ml di campione e conservarlo a -20 ° C in una provetta per centrifuga coniche. Misurare e registrare la densità ottica del campione mettendo un paio di gocce di urina nel rifrattometro. Filtrare il campione attraverso un filtro da 0,2 um. Misurare il volume del campione al di sotto in base alla densità ottica 1,000-1,009 1,00 ml 1,010-1,019 0,50 ml 1,020-1,050 0,25 ml + 0,25 ml di H 2 O Il volume specificato non è poi trasferito in un Reactivial contenente le seguenti norme interne: 500 nanomoli (nmoli) 3 Creatina, 10 nmoli d 3 acido metilmalonico, 100 nmoli ciascuno dei seguenti 13 C 3 lattato, 13 C 3 piruvato, 13 C 2 15 N glicina, serina d 3, d 5 fenilalanina, D 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotato, d 4 acido sebacico, 13 C 6 glucosio, d 6 inositolo e d 5 triptofano. 20 microlitri (microlitri) di un 7,5 Unità / ul di soluzione di ureasi (Calzyme catalogo Laboratori no. 116A0100) viene aggiunto al campione, che viene poi lavata e sigillato in CO 2 attraverso un setto inerte. Il campione è a 37 ° C per 30 minuti con il gas di biossido di carbonio aggiunto a intervalli di 15 minuti per mantenere la pressione. 20 l più della soluzione di ureasi si aggiunge, il flacone viene lavata con l'anidride carbonica, e il campione mantenuto a 37 ° C per altri 15 minuti. 500 ml di acetone 30:70: metanolo viene aggiunto, il setto di gomma viene sostituito con un setto rivestito in teflon, e il campione viene raffreddato a -20 ° C per 15 minuti. Solidi vengono rimossi mediante centrifugazione a 1500 rpm x 10 minuti, poi travasata in un ambiente pulito 2,0 cc Reactivial (Supelco / Sigma) Aggiungi trifluoroacetato triethylammonium (TEA / TFA) (Sigma) come segue: 20 l per 1,00 ml campioni 40 microlitri per 0,5 ml, o meno, i campioni Top fuori con acetonitrile e di luogo in un flusso di azoto a 70 ° C fino a volume costante si ottiene (TEA / TFA rimarrà) (~ 15 minuti). Ripetere il passaggio 13, fino a 4 volte fino a quando si forma un precipitato (~ 10 minuti ciascuno). Lasciate raffreddare per circa 2 minuti. Top fuori con cloruro di metilene, facendo attenzione di ebollizione, e secco (~ 4:00 minuti). Ripetere il punto 15. Aggiungi MSTFA (N-metil-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (termica scientifico) alle seguenti tariffe: 150 microlitri per 1,00 ml campioni 200 ul per 0,50 ml, o meno, i campioni Cap in atmosfera di azoto e incubare a 70 ° C per 1 ora. Trasferimento a microprovette, in atmosfera di azoto, per l'analisi dei gas cromatografo / spettrometro di massa. Microprovette posto per l'iniezione automatizzato dal 5975 Agilent GC / MS: le temperature dello strumento sono: iniettore 200 ° C, l'interfaccia di 250 ° C, forno a 80 ° C per 1 minuto; rampa a 4 ° C / minuto 80-130 ° C, rampa 6 ° C / minuto 130-200 ° C, rampa a 12 ° C / minuto 200-285 ° C, mantenere per 10 minuti. Colonna: 25 m, 320 micron ID, spessore 0.5 micron DB-5. Mass Spec: fonte 230 ° C, quad 150 ° C, Scansione 50-650 amu a 2,46 scansioni / sec. Solvente pausa di 3,5 minuti. Rappresentante Risultati Si prega di cliccare qui per vedere i risultati rappresentativi.

Discussion

Il metodo di ureasi (1) è stato citato 62 volte nella letteratura medica con varie modifiche. Gruppo di Matsumoto (2,3) ha semplificato la procedura per l'high-throughput screening neonatale e riportato i risultati da 16000 pazienti. Kuhara e altri (4-7) hanno riportato l'utilizzo del metodo in diversi casi di diagnosi degli errori congeniti e follow-up. Rhead (8) ha confermato l'utilità del metodo per la diagnosi clinica e follow-up di errori congeniti. Il metodo è stato applicato a urina di orsi, topi knock-out, elefanti e omogenati di mosche frutti interi e le loro larve (9). Terreni di coltura da Cryptococcus prima e dopo la mutagenesi sito-diretta sono stati analizzati, senza il passaggio ureasi (10). Il metodo è stato applicato per la valutazione dei nutrizionale studenti di medicina, pazienti con sindrome di Down e anziani dementi veterani dopo aver caricato i soggetti con dosi orali degli aminoacidi triptofano, metionina ed isoleucina (11). Tutti gli otto vitamine del gruppo B sono stati valutati da quantificare il prodotti di degradazione dei tre aminoacidi che, tra i quali, che tutte le 8 vitamine ad un certo punto della loro degradazione. Gli effetti tossici dei farmaci e la loro mitigazione da supplementazione di vitamina è stata riportata (12). Campioni di liquido amniotico da gravidanze normali e sindrome di Down sono stati analizzati e riportati (13-15).

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
MSD 5975		Agilent		GC/MS/Computer
MSD 5973		Agilent		GC/MS/Computer
Urease		Calzyme	116A0100	Also Sigma C3
Stable Isotope Standards		CDN Isotopes, Isotec, Cambridge Isotope Lab
Solvents		Fisher
Analytes		Sigma, Universidad Autonoma de Madrid, Ernesto Brunet
GC Columns		J&W Scientific	123-5026
TEA/TFA		Fluka/Sigma	09747
Vials		Supelco/Sigma	Z115088/12EA
Merlin Microseal		Agilent	5181-8815
MSTFA		Thermal Scientific	48913