Подготовка сердца дрозофилы: Техника для изучения физиологии сердца во взрослой мухе

Overview

Это видео описывает взрослое сердце мухи, или иным образом называется Дрозофила спинной сосуд. Рекомендуемый протокол демонстрирует процедуру вскрытия для подготовки живого сердца.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Vogler и Ocorr, визуализации бьющееся сердце в Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).

1. Перед началом

1. Свежеприготовленный искусственный гемолимф (AH) раствор, содержащий 108mMNa, 5mM КЗ, 2mM Ca², 8mM MgCl₂, 1mM₂PO₄, 4mM NaHCO₃, 10mM сахароза, 5 мм трегалоза, 5мМ HEPES (pH 7.1, все реагенты из Sigma химических веществ). Сахароза и трегалоза должны быть добавлены в AH из охлажденных растворов запасов непосредственно перед использованием для предотвращения бактериального загрязнения.
2. Довнесите AH до комнатной температуры и ордылив раствор воздухом в течение не менее 15 минут.
3. Потяните несколько тонких капилляров (например, стеклянные капилляры, 100ul, VWR), необходимых для удаления жира.

2. Полутронутые сердце Дрозофилы от взрослой мухи

1. Взрослые мухи дрозофилы обезболены с Помощью Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) в течение 2-5 минут. Необходимо позаботиться о том, чтобы не оставлять мух в Fly Nap для более длительных экспозиций. Краткосрочное воздействие холода также может быть использовано для обезболивать мух, но CO_{2 не} рекомендуется, поскольку он имеет более длительное воздействие на пульс и ритмичность.
2. Анестезированные мухи помещаются, спинной стороной вниз, в чашку Петри, покрытую тонким слоем вазелина. Гидрофобные кутикулы в крыльях и теле обратимо "прилипнуть" к желе, но муха может быть перемещена в случае необходимости. Это становится особенно важным во время последующих манипуляций.
3. Первоначальный разрез делается с помощью изогнутой пары весенних ножниц (Roboz #5611). Ножницы лезвия помещаются под ноги и угловой вниз к спинной поверхности грудной клетки возле шеи. Голова, брюшной нервный шнур и ноги удаляются одним разрезом. Препарат затем погружается в кислородом, искусственный гемолимф (AH) раствор.
4. С помощью весенних ножниц задний кончик живота (состоящий из сегментов брюшной полости 7 и 8) удаляется одним разрезом. Это обеспечивает доступ для принятия боковой сокращений по обоим краям живота и служит для разрыва связи между задней кишки и брюшной кутикулы. Освобожденный лоскут брюшной кутикулы затем удаляется.
5. В шагах 3 и 4 передние и задние соединения кишечника разорваны, так что органы брюшной полости в настоящее время проводятся на месте только трахеолы. Кишечник и другие органы брюшной полости, как правило, могут быть удалены в качестве одной массы с помощью миппов ювелира (Roboz, #55) и нежный дергая. Удаление внутренних органов показывает бьющееся сердце трубки по-прежнему прилагается к спинной кутикулы в окружении жировых тел.
6. Толстые тела довольно непрозрачны в световом микроскопе, следовательно, часто необходимо удалить часть этого жира, чтобы увидеть сердечную трубку ясно. Это достигается с помощью техники липосакции с использованием тонко нарисованных стеклянных капилляров. Капилляры сделаны с помощью стандартного пипетного шкива (например, Саттер P-97 Pipette Puller), а затем вставляются в пластиковые трубки (Tygon, 1/16), прикрепленные к вакууму источника. Эта система используется для всасывания избыточного жира со всей сердечной трубки. Сила всасывания пропорциональна диаметру кончика, поэтому не следует использовать пипетки с наконечниками диаметром более 40 микрон. Необходимо принять крайнюю осторожность, чтобы избежать прикосновения к самому сердцу и потому, что задняя часть сердца очень хрупкая, что регион следует избегать вообще.
7. Взрослый Drosophila сердце трубки в настоящее время подвергается и должны биться. При необходимости кутикулу и прикрепленное сердце можно изменить, аккуратно подняв кутикулу из вазелина и тщательно укрощение ее обратно вниз, опять же избегая любого контакта с сердечной тканью. На этом этапе раствор купания препарата следует заменить свежим АХЛ. Этот препарат должен быть допущен к эквилибрации в течение 20-30 минут с оксигенацией до каких-либо манипуляций. Если препарат будет поддерживаться дольше 60 минут, его следует перелить свежим аХЛ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Good for gross cuts (Step 2)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11295-10
Glass Capillaries, fine	Science Products	GB100T8P
Pipette Puller	Sutter Equipment	P-97	Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing	Tygon	1/16" inner diameter	for 100 µl capillaries
Histoacryl® tissue adhesive	B. Braun Medical