Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici
Summary
In questo video-articolo vi presentiamo un metodo per isolare singoli o multipli<em> Drosophila</em> Neuroni da dalla terza larve instar utilizzando la cattura a infrarossi (IR) classe di Microdissection Capture laser (LCM). RNA ottenuto dal neuroni isolati può essere facilmente utilizzato per applicazioni a valle compresa qRT-PCR o analisi di microarray.
Abstract
L'arborizzazione dendritica (bis) i neuroni del sistema nervoso periferico Drosophila (PNS) forniscono un eccellente sistema modello in cui studiare i meccanismi molecolari alla base specifiche della classe 1,2 morfogenesi dendrite. Per facilitare l'analisi molecolare di specifiche della classe da neurone sviluppo, è vitale per ottenere queste cellule in una popolazione pura. Anche se una serie di cellule diverse, e tessuto-specifica delle tecniche di isolamento dell'RNA esistono per le cellule di Drosophila, compresi magnetico purificazione tallone cellula base 3,4, Fluorescente cell sorting attivato (FACS) 5-8, e le proteine RNA binding strategie basate 9, nessuno dei questi metodi possono essere facilmente utilizzati per isolare una o più specifiche della classe Drosophila da neuroni con un alto grado di precisione spaziale. Microdissezione cattura laser (LCM) è emerso come uno strumento estremamente potente che può essere utilizzato per isolare specifici tipi cellulari da sezioni di tessuto con un alto grado di risoluzione spaziale e di precisione. RNA ottenuti da cellule isolate possono poi essere utilizzati per le analisi incluse qRT-PCR e microarray il profilo di espressione all'interno di un dato tipo di cellula 10-16. Fino ad oggi, LCM non è stato ampiamente applicate all'analisi dei tessuti e delle cellule di Drosophila 17,18, compresi i neuroni da al terzo stadio larvale instar di sviluppo.
Qui vi presentiamo il nostro protocollo ottimizzato per l'isolamento di Drosophila neuroni da utilizzare la porta a infrarossi (IR) classe di LCM. Questo metodo consente la cattura di singoli, i neuroni specifiche della classe o da più con alta specificità e risoluzione spaziale. Di pari età larve terzo instar esprimendo un UAS-mCD8:: GFP 19 transgene sotto il controllo sia della classe IV da neurone specifico ppk-GAL4 20 driver o il pan-da neurone specifico 21-7-21 GAL4 autista sono stati utilizzati per questi esperimenti. RNA ottenuto dal neuroni isolati da è di qualità molto elevata e possono essere direttamente utilizzate per applicazioni a valle, tra cui qRT-PCR o analisi di microarray. Inoltre, questo protocollo LCM può essere facilmente adattato per catturare altri tipi di cellule di Drosophila uno diverse fasi di sviluppo dipende dal tipo di cellule specifiche, GAL4-driven pattern di espressione di GFP.
Protocol
Discussion
Il protocollo presentato nel presente documento descrive il nostro metodo ottimizzato per l'isolamento dei neuroni Drosophila periferiche mediante LCM. Anche se questo protocollo LCM è stato progettato per l'isolamento specifico di singole, specifiche della classe o più neuroni da Drosophila dal terzo stadio larvale instar di sviluppo, piccole modifiche del protocollo può essere facilmente adattato per la cattura di altri tipi di cellule di Drosophila da ogni sviluppo fasi distinte …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Drs. Yuh-gen Nung e Wes Grueber per la fornitura di scorte di volo utilizzato in questo studio, e Virginia Espina, il Dott. Emanuel Petricoin e il Dr. Lance Liotta per l'assistenza con LCM. Gli autori riconoscono la F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust per il supporto di questa ricerca (DNC) e la George Mason University Provost Ufficio s (EPRI).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
| RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
| Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
| ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
| Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
| Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
| CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
| 75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
| Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
| Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
| 70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
| Dry ice |
Equipment:
- Cryostat
- 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
- -80°C freezer
- Incubator
- PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)
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