फिक्स्ड और जीवित कोशिकाओं में प्रवाह cytometry द्वारा Calpain गतिविधि को मापने
Summary
यह आलेख तय की और जीवित कोशिकाओं में प्रवाह cytometry का उपयोग calpain गतिविधि को मापने के लिए प्रोटोकॉल विस्तार होगा.
Abstract
Calpains सर्वव्यापी intracellular कैल्शियम के प्रति संवेदनशील, तटस्थ सिस्टीन proteases<sup> 1</sup>. Calpains संकेतन, cytoskeletal remodeling, जीन की अभिव्यक्ति, apoptosis के विनियमन और कोशिका चक्र प्रगति सहित कई शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं<sup> 1</sup>. Calpains पेशी अपविकास, कैंसर, मधुमेह, अल्जाइमर रोग और एकाधिक काठिन्य सहित कई विकृतियों में फंसा<sup> 1</sup>. Calpain विनियमन जटिल और अधूरे से समझा है. mRNA और प्रोटीन के स्तर गतिविधि के साथ खराब सहसंबंधी, calpain गतिविधि को मापने के लिए जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति की तकनीक का उपयोग सीमित. इस वीडियो प्रोटोकॉल विवरण तय की और जीवित कोशिकाओं में calpain गतिविधि को मापने के लिए हमारी प्रयोगशाला में एक प्रवाह cytometric परख विकसित किया है. इस विधि का उपयोग करता है फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट बीओसी LM-CMAC, जो विशेष रूप से calpain द्वारा cleaved है calpain गतिविधि को मापने के लिए है.<sup2></sup> इस वीडियो में, तय की और रहने वाले murine 32Dkit लेकिमिया कोशिकाओं, अकेले या एक splenocyte जनसंख्या का भाग के रूप में calpain गतिविधि में एक LSRII (बायोसाइंस बी) का उपयोग करने के लिए मापा जाता है. 32Dkit कोशिकाओं को ऊंचा गतिविधि सामान्य splenocytes की तुलना में दिखाए जाते हैं.
Protocol
Discussion
इस वीडियो प्रोटोकॉल में तय की और रहने वाले 32Dkit कोशिकाओं में calpain गतिविधि निर्धारित किया गया है. Calpain PD150606 अवरोध करनेवाला के साथ सेल लाइन का उपचार कोशिकाओं में calpain गतिविधि के पूर्ण निषेध के परिणामस्वरूप. इसके …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान, लेकिमिया और लिंफोमा सोसायटी और कनाडा के लिंफोमा फाउंडेशन कनाडा के संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde |
Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
||
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | ||
| PD98059 | Cell Signaling Technology | |||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes |
Invitrogen | |||
| LSR II | BD Bioscience | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
Riferimenti
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. . The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
