Измерение кальпаин деятельности в фиксированных и живых клеток методом проточной цитометрии
Summary
В этой статье мы подробно протокол для измерения кальпаин деятельность в фиксированных и живых клеток методом проточной цитометрии.
Abstract
Кальпаинов повсеместно внутриклеточный кальций-чувствительным, нейтральных протеаз цистеина<sup> 1</sup>. Кальпаинов играют важнейшую роль во многих физиологических процессах, в том числе сигнализации, цитоскелета, ремонт, регуляция экспрессии генов, апоптоза и прогрессии клеточного цикла<sup> 1</sup>. Кальпаинов были замешаны во многих патологий, в том числе мышечные дистрофии, рак, диабет, болезнь Альцгеймера и рассеянный склероз<sup> 1</sup>. Кальпаин регулирования является сложным и полностью понятны. мРНК и белка слабо коррелируют с активностью, что ограничивает использование методов генной экспрессии белка или для измерения кальпаин деятельности. Это видео подробно протокол проточной цитометрии анализа, разработанные в нашей лаборатории для измерения кальпаин деятельность в фиксированных и живых клеток. Этот метод использует флуоресцентные подложки ВОС-LM-CMAC, которая расщепляется в частности, путем кальпаин, измерить кальпаин деятельности.<sup> 2</sup> В этом видео, кальпаин деятельности в основной и живые мышиные 32Dkit лейкозных клеток, в одиночку или в составе спленоцитов населения измеряется с помощью LSRII (BD Bioscience). 32Dkit клетки показано, что повышенная активность по сравнению с нормальными спленоцитов.
Protocol
Discussion
Деятельности кальпаин в фиксированных и живых клеток 32Dkit была определена в этом видео протокол. Лечение линию клеток с ингибитором кальпаин PD150606 привело к полному торможению кальпаин активности в клетках. Кроме того, лечение ингибиторами MEK1 PD98059 привело к полному торможению кальпаин ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддержке грантов от канадского института исследований в области здравоохранения, лейкемии и лимфомы общества Канады и лимфомы Фонд Канады.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde |
Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
||
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | ||
| PD98059 | Cell Signaling Technology | |||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes |
Invitrogen | |||
| LSR II | BD Bioscience | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
Riferimenti
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. . The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
