Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה
Summary
Quantitation של גדיל הדנ"א הכפול נשבר על בסיס γH2AX מוקדים הפך כלי רב ערך, במיוחד בביולוגיה קרינה, להערכת radiosensitivity רקמות ההשפעות של תרכובות קרינה שינוי. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה.
Abstract
גדיל הדנ"א הכפול הפסקות (DSBs) הם נגעים קטלני במיוחד genotoxic, כי יכול להיווצר גם על ידי תהליכים פנימיים (פיזיולוגי או פתולוגי) או על ידי גורמים חיצוניים, קרינה מייננת במיוחד ותרכובות radiomimetic. זירחון של הגרסה H2A היסטון, H2AX, על שאריות סרין-139, את מוטיב שמור ביותר SQEY בטרמינל C-, להרכיב γH2AX, היא תגובה מוקדמת הדנ"א הכפול גדיל הפסקות<sup> 1</sup>. אירוע זה זירחון מתווכת על ידי phosphatidyl inosito-3-kinase (PI3K) משפחה של חלבונים, אטקסיה telangiectasia מוטציה (ATM), ה-DNA למקטע החלבון קינאז קטליטי ATM ו RAD3 הקשורות (ATR)<sup> 2</sup>. בסך הכל, התוצאות DSB אינדוקציה היווצרות של בדידות גרעיני γH2AX מוקדים אשר ניתן לאתרם בקלות באמצעות מיקרוסקופ ונרשמת immunofluorescence<sup> 2</sup>. לאור רגישות וספציפיות ייחודי של סמן זה, ניתוח של γH2AX מוקדים הובילה למגוון רחב של יישומים במחקר ביו, במיוחד בתחום הביולוגיה והרפואה קרינה גרעינית. Quantitation של γH2AX מוקדים נחקר נרחב ביותר במערכות תרבית תאים בהקשר של קרינה מייננת הנגרמת DSBs. מלבד radiosensitivity הסלולר, מבחני מבוסס immunofluorescence יש גם שימש כדי להעריך את היעילות של קרינה שינוי תרכובות. בנוסף, γH2AX שימש כסמן מולקולריים כדי לבחון את היעילות של DSB וישכנע תרכובות שונות היא בישרה לאחרונה להיות כסמן חשוב של הזדקנות ומחלות, בעיקר סרטן<sup> 3</sup>. יתר על כן, immunofluorescence שיטות מבוססות הותאמו זיהוי חליפה quantitation של γH2AX מוקדים<em> לשעבר vivo</em> ו<em> In vivo</em<sup> 4,5</sup>. הנה, אנחנו מדגימים שיטה immunofluorescence טיפוסי עבור איתור quantitation של γH2AX מוקדים ברקמות העכבר.
Protocol
Discussion
לצורך הפגנה זו השתמשנו רקמת הריאה עכבר Balb מטופל / עכברים c ומ במודל של עכברים של מחלה כרונית בדרכי הנשימה אלרגית. אנו ונרשמת הבדלים במספר מוקדים לכל תא עם ממוצע גבוה מעט יותר נצפתה בריאה פגום לעומת חלקים לא מטופלים. באופן ספציפי, quantitation הצביעו 6.5 מוקדים לכל תא / ו -9.4 לכל ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
התמיכה של המכון האוסטרלי גרעיני מדע והנדסה הוא הודה. TCK היה זכה בפרסים AINSE. המעבדה לרפואה epigenomic נתמכת הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (566,559). LM נתמך על ידי מלבורן מחקר (אוניברסיטת מלבורן) ו ביו הדמיה מלגות CRC משלים. התמיכה של מונש Micro Imaging (ד"ר סטיבן קודי ואת היתר קרמייקל) היה שלא יסולא בפז עבור עבודה זו. MMT הוא אסיר תודה על הסיוע מומחה ועצות ד"ר אולגה Sedelnikova מן המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
Riferimenti
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
