Genetik mühendisliği ya da büyük örneklem büyüklüğü gerektirmeden, hassas bir doğal protein-protein etkileşimleri, sağlam, biyokimyasal değerlendirme sağlar IP-FCM yöntem sunulmuştur.
Flow sitometri (IP-FCM) tarafından tespit Immunoprecipitation protein-protein etkileşimleri tespit edilmesi ve ölçülmesi için etkili bir yöntem. Temel ilke yakalanan birincil analit multiprotein kompleksleri içinde fiziksel olarak ilişkili diğer molekülleri ile birlikte tespit edilebilir neyin sandviç ELISA uzanır. Prosedürü, monoklonal antikorlar (mAb) belirli bir protein ilgi immunoprecipitating hücre lizatları bu boncuklar kuluçka florokrom-konjuge problar ile yakalanan protein kompleksleri sondalama ve boncuk ilişkili floresan flow sitometri analiz ile polistiren lateks mikro kovalent kaplin içerir. IP-FCM, son derece duyarlı, kendi ana (denatüre) devlet proteinlerin analizi sağlar ve iki yarı-kantitatif veya kantitatif analiz için uygun. IP-FCM ek avantajlar olarak, bir akış sitometresinde dışında hiçbir genetik mühendisliği ya da özel ekipman gerektirir ve yüksek hacimli uygulamalar için kolayca adapte edilebilir.
Protein-protein etkileşimleri hakkında bilgiler, sinyal iletimi, soy olgunlaşma, hücre döngüsü ilerlemesi, ve apoptozis kaskadlar gibi birçok hücresel süreçlerin analiz son derece alakalı. IP FCM proteinlerin etkileşimi incelemek ve kendi ana yapısındaki multiprotein kompleksleri üyeleri tanımlamak için, hızlı, kantitatif ve hassas bir şekilde sağlar. Boncuk ve hücre lizatları ile inkübe birleştiğinde, bir günde ve probed ve ertesi gün analiz edilebilir olabilir. 96-plaka biçimi, etkin veri toplama, istatistik veya tarama amacıyla sağlamak için bir anda analiz edilmesi gereken çok sayıda numune sağlar. Floresan boncuk standartlarını kullanarak, her bir boncuk tarafından yakalanan proteinlerin sayısını tahmin edilebilir. Çok küçük kaynak materyal yakalama ve tespiti için gerekli, bu yüzden sınırlı örnekler ve kıt analitler hala çok etkileşim için analiz edilebilir. IP-FCM fizyolojik olmayan bir ortamda proteinlerin karıştırma, genetik mühendisliği, epitop etiketleme, denatürasyon, ya da in-vitro gerektirmese de, uygulanabilirliği ile erişilebilir ve değerli bir araç, bu ve diğer teknikler ile birleştiğinde olabilir birçok biyolojik sistemler.
Sorun Giderme:
Birçok IP FCM deneyler yararlı protein etkileşim verileri ilk kez denenir üretir. Ancak, IP-FCM optimizasyonu, boncuk, protein kompleksi yakalama ve bağlayıcı floresan prob antikor konjugasyon artırabilir.
IP antikor konjugasyon verimliliği doğrudan bir anti-immünglobulin antikor ile birleştiğinde boncuk problama tarafından tespit edilebilir. Bu verimliliği düşükse, kaplin reaksiyon sırasında antikor konsantrasyonunu arttırarak daha fazla IP antikorları her boncuk takmak için izin verebilirsiniz. Bu analitlerin gelişmiş yakalama ve algılama, IP boncuk toplu bağlama kapasitesi artırabilir. Diğer birincil amin içeren moleküllere (örneğin Tris, sığır serum albumin), bu düşük mAb kaplin boncuk eki ve sonuç için mAb ile rekabet gibi kaplin reaksiyon sırasında mevcut olmamalıdır. Boncuk mAb konjugasyon başka nedenlerden dolayı sorun olursa, boncuk yerine avidin / streptavidin birleştiğinde olabilir ve biotinlenmiş antikorlar daha sonra non-kovalent bağlı immunprecipitation için kullanılan olabilir.
Iyi antikor konjugasyon rağmen, boncuk ilişkili floresan ilk algılama düşük olabilir. Birincisi, karmaşık yakalama kendisi düşük olabilir. IP-FCM, birim lizis hacim başına parçalanan hücrelerin sayısı artan analit konsantrasyonuna bağlı olduğundan analit yakalama ve algılama artırabilir. Ayrıca, yakalama, yakalanan az boncuklar arasında kompleksleri, ve probed boncuk başına ortalama floresan sonuçları dağıtır lizat ile inkübe IP boncuk sayısının azaltılması artabilir. İkincisi, yakalanan kompleksleri prob antikor erişim sterik immunoprecipitating antikor tarafından engellendiği mümkündür. Bu durumda, sorun ve / veya prob yakalamak için farklı antikorları kullanarak ele alınabilir.
Bu çalışma Eagles İnovasyon Ödülü (Eagles Kardeş Sipariş) ve Mayo Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics Corporation/Molecular Probes | 2-5000 | Store at 4°C. |
Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma | M-5287 | |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Pierce Sigma |
22980 E-6383 |
Store at -20°C under desiccating conditions. |
Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |