Dit document heeft tot doel de lezer in de exploitatie van een geïntegreerde atomic force-microscoop optische beeldvorming instrueren voor de mechanische stimulatie van levende cellen in cultuur. Een stap-voor-stap protocol wordt gepresenteerd. Een representatieve dataset die levende cellen als reactie op mechanische stimulatie shows gepresenteerd.
Om te begrijpen het mechanisme waarmee levende cellen zin mechanische krachten, en hoe ze reageren en zich aanpassen aan hun omgeving, een nieuwe technologie in staat om cellen gedrag te onderzoeken op sub-cellulair niveau met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie is ontwikkeld. Zo werd een atomic force microscoop (AFM) geïntegreerd met een totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie en snel draaiende schijf (FSD) confocale microscopie. Het geïntegreerde systeem is breed toepasbaar in een breed scala van moleculaire dynamische studies in alle aanhangend levende cellen, waardoor de directe optische beeldvorming van de cel responsen aan mechanische stimulatie in real-time. Belangrijke herschikking van de actine filamenten en focale adhesies bleek te wijten aan de lokale mechanische stimulatie bij de apicale celoppervlak dat veranderingen veroorzaakt in de cellulaire structuur in de cel lichaam. Deze innovatieve technieken zal nieuwe informatie voor inzicht in levende cellen herstructurering en dynamiek in reactie op mechanische kracht. Een gedetailleerd protocol en een representatieve dataset te tonen dat levende cellen als reactie op mechanische stimulatie worden gepresenteerd.
Cytoskelet 7-10 en 11-16 focale adhesies zijn dynamische structuren die samen te stellen, verspreiden en draai dan als cellen migreren of te reageren op mechanische kracht 17. Ze hebben belangrijke functies in het reguleren van de celgroei, overleving, en genexpressie. Het kennen van hun specifieke verdeling en dynamiek zorgt voor een beter begrip van hoe cellen communiceren met de matrix en onderling.
Dit nieuwe microscoop systeem is breed toepasbaar in een …
The authors have nothing to disclose.
Vinculin-GFP plasmide was een geschenk van Kenneth Yamada, National Institutes of Health, National Institute of Dental en Craniofaciale Onderzoek, Bethesda, Maryland, en actine-mRFP plasmide was een geschenk van Michael Davidson, Florida State University, Tallahassee, Florida.
Dit werk werd ondersteund door NSF Career Award # 0747334 en AHA-Nationaal SDG # 0835205N naar Andreea tranche.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
AFM tip | Novascan Technologies | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | ||
avidin | Sigma Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F4759 | 1 mg/mL | |
DPBS | Invitrogen | 21600-051 | ||
Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza | VPI-1004 | ||
Mattek glass bottom dishes | MatTek Corporation | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |