Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase
Summary
הפעילות של decarboxylase ועין מתנהלת ליזין מנוטר על ידי מגיבים המצע L-ליזין לבין המוצר קדברין עם חומצה 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-לטופס adducts כי יש מסיסות ההפרש ב טולואן.
Abstract
Escherichia coli הוא חיידק enteric כי הוא מסוגל לגדול על פני טווח רחב של ערכי ה-pH (pH 5-9) 1, לא ייאמן, הוא מסוגל לשרוד חומצה קיצונית מדגיש כולל מעבר דרך הקיבה יונקים שבו pH יכול ליפול נמוך כמו pH פבואר 01-02. כדי לאפשר כזה מגוון רחב של הישרדות pH חומצי, א coli בעלת ארבעה שונה ועין מתנהלת חומצה אמינית decarboxylases כי המצע שלהם decarboxylate חומצות אמינו בצורה פרוטון תלויי ובכך להעלות את ה-pH הפנימי. Decarboxylases כוללים חומצה גלוטמית decarboxylases GadA ו GadB 3, decarboxylase ארגינין עדיה 4, decarboxylase ליזין LdcI 5, 6 ו decarboxylase ornithine SpeF 7. כל אנזימים אלה לנצל pyridoxal-5'-phospate כגורם משותף 8 ולתפקד יחד עם המצע מוצר antiporters-הקרום הפנימי להסיר מוצרים decarboxylation למדיום חיצוני תמורת מצע טרי 2. במקרה של LdcI, antiporter ליזין-קדברין נקרא CadB. לאחרונה, אנו נקבע את מבנה רנטגן של גביש LdcI ל 2.0, ואנו גילו מולקולה קטנה, רומן חייב LdcI התגובה מחמירים הרגולטור guanosine 5'-diphosphate, diphosphate 3'-(ppGpp) 14. התגובה מחמירים מתרחשת כאשר התאים גדל באופן אקספוננציאלי ניסיון חסך תזונתי או אחת למספר מדגיש אחרים 9. כתוצאה מכך, התאים לייצר ppGpp שמוביל מפל איתות ששיאה במעבר גידול מעריכי לגידול שלב נייח 10. אנחנו הוכיחו כי ppGpp הוא מעכב ספציפי של LdcI 14. כאן אנו מתארים את assay decarboxylase ליזין, שונה מן assay שפותחה על ידי Phan et al. 11, שיש לנו כדי לקבוע את הפעילות של LdcI והשפעת pppGpp / ppGpp על פעילות זו. התגובה decarboxylation LdcI מסיר את קבוצת α-carboxy של L-ליזין מייצרת פחמן דו חמצני קדברין polyamine (1,5-diaminopentane) 5. L-ליזין קדברין ניתן הגיבו 2,4,6-trinitrobenzensulfonic חומצה (TNBS) ב-pH גבוה כדי לייצר N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-קדברין) ו-N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-ליזין), בהתאמה 11. TNP-קדברין ניתן להפריד TNP-ליזין כמו לשעבר הוא מסיס בממסים אורגניים כגון טולואן בזמן האחרון הוא לא (ראו תרשים 1). טווח ליניארי של assay נקבע באופן אמפירי באמצעות מטוהרים קדברין.
Protocol
Discussion
ב assay decarboxylase ליזין, TNBS הוא הגיב עם אמינים העיקרי של L-ליזין קדברין כדי ליצור TNP-ליזין TNP-קדברין adducts (איור 1). בשל נוכחותם של הקבוצה חומצה carboxylic על TNP-ליזין, adduct זה נשאר מסיסים במים בעוד TNP-קדברין, חסרה הקבוצה חומצה carboxylic, הוא מסוגל מחיצות לתוך טולואן 11. סוג זה של assay יכו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר ד"ר מיכאל קאשל (National Institutes of Health, Bethesda, מסצ'וסטס, ארה"ב) לשליחת לנו זני חיידקים, פלסמידים, ופרוטוקולים הצורך. אנו מודים לד"ר ג'ון גלובר (המחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת טורונטו) לשימוש של הקורא צלחת SpecraMax. בבריטניה הוא מקבל הלאומית למדעים והנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) מלגות לתארים מתקדמים, המכון הקנדי של תוכנית הבריאות הדרכה אסטרטגי מחקר בביולוגיה מבנית של חלבונים בממברנה הקשורים למחלה, וכן אוניברסיטת אחוות פתח טורונטו. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הקנדי לחקר הבריאות (MOP-67210) כדי וואה.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
Riferimenti
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochimica. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D., Curtiss, R., Neidhardt, F. C. . Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l., Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
