더블 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션
Summary
이 프로토콜은 아닌 방사성을 포함<em> 원위치</em척추 두뇌의 얇은 부분에서, 단일 셀 해상도로 두 사본 종의 동시 확인 가능> 하이브 리다이 제이션 절차.
Abstract
여기서 우리는 두 형광의 수정된 버전을 설명<em> 현장에서</em> 하이브 리다이 제이션 (dFISH) 메소드 신선한 냉동 뇌 부분에 대한 관심의 두 mRNAs 검출에 최적화된. 우리 그룹은 성공적으로 유전자 공동 규제를 공부하기 위해이 방법을 사용하고 있습니다. 더 구체적으로, 우리는 단세포 해상도의 해부 조직 neurochemical 특성, 및 중앙 감각 회로의 감각적 경험의 영향을 탐험이 dFISH 방법을 사용했습니다. 이 프로토콜은 쥐, 쥐 및 노래하는 새는에서 뇌 조직에서 검증된되었지만 쉽게 다른 척추 종 적용할뿐만 아니라 이외의 신경 조직의 배열로 될 예정입니다. 이 영화에서 우리는이 절차의 주요 단계에 대한 자세한 데모를 제공합니다.
Protocol
이 프로토콜은 이전에 뇌 조직 1-7에 하나 또는 두 개의 사본 수종을 감지하는 우리와 다른 사람에 의해 개발된 표준 방사선이 아닌 방사선 원위치 하이브리드화 방법에 따라 개발 및 정제되었다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 최종 사용자가 선택한 절차 중단의 수에 따라 2 ~ 3 일 총 길이있다. 아래의 자세한 모든 단계가 riboprobe의 하이브리드화 단계 및 사후 하이브 리다이 제이션…
Discussion
우리는 척추 두뇌가 neurochemically 및 기능 구성 방법 연구, 어떻게 behaviorally – 관련 감각 자극에 미치는 영향 성인 뇌 8-10에서 뉴런의 게놈 기기 확인하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 우리는 성공적으로 마우스, 쥐 그리고 노래하는 새는에서 뇌 조직에서이 방법을 사용하지만,이 프로토콜은 척추 동물의 배열, 그리고 아마도이 아닌 신경 조직에서 얻은 뇌 부분에 쉽게 적용할 수?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH / NIDCD 및 RP에 슈미트 재단의 보조금에 의해 지원 작동합니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DEPC | VWR | IC15090225 | toxic substance | |
| PCR purification kit | QIAgen | 28104 | ||
| Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | toxic substance | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | ||
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | ||
| Tris-HCl (1 M, pH 7.5) | VWR | IC816124 | ||
| MgCl2 (1 M) | Sigma | 449172 | ||
| Spermidine (1 M) | Sigma | S0266 | ||
| DIG RNA labeling mix | Roche | NC9380805 | ||
| Biotin RNA labeling mix | Roche | NC9440104 | ||
| RNasin | Promega | N2111 | ||
| BSA | Sigma | 05491 | ||
| DTT | Sigma | D5545 | ||
| Sephadex G50 | VWR | 95016-772 | ||
| EDTA | VWR | 101384-758 | ||
| SDS | Sigma | L4390 | ||
| Transfer (t)RNA | Invitrogen | 15401011 | ||
| 10X MOPS | VWR | 14221-398 | toxic substance | |
| Paraformaldehyde | VWR | AAAL04737-36 | toxic substance | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | ||
| NaOH | VWR | SX0600-1 | ||
| Triethanolamine | VWR | IC15216391 | ||
| Acetic anhydride | VWR | MK242002 | toxic substance | |
| SSPE | VWR | 82021-488 | ||
| Formamide | VWR | JT4028-1 | toxic substance | |
| Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| Mineral oil | VWR | IC15169491 | ||
| Chloroform | VWR | BDH1109 | organic solvent | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | toxic substance | |
| Hydrogen peroxide | VWR | VW36901 | toxic substance | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | ||
| Triton X-100 | J. T. Baker | X198-05 | ||
| Anti-DIG HRP | Roche | 11093274910 | ||
| Anti-biotin peroxidase | Vector | SP3010 | ||
| TSA Alexa Fluor 594 | Invitrogen | T20935 | ||
| TSA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | T20932 | ||
| Hoechst | VWR | 200025-538 | ||
| Vectashield | Vector | H-1000 | ||
| embedding mold | VWR | 15160-157 | ||
| cryostat | Leica | CM 1850 | ||
| Superfrost plus slide | VWR | 89033-052 |
Solutions
- Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
- Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
- TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
- TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
- TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
- Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
- Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.
Riferimenti
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- Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
- Pinaud, R., Jeong, J. K. Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol. 611, 115-129 (2010).
Citazione di questo articolo
Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L. A., Pinaud, R. Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections. J. Vis. Exp. (42), e2102, doi:10.3791/2102 (2010).