L'isolement des cellules endothéliales valvulaires
Summary
Nous fournissons une méthode pour isoler et cultiver des populations pures de cellules endothéliales valvulaires cardiaques (VEC). VEC peuvent être isolées de chaque côté de la pointe ou un dépliant et immédiatement après, sous-jacente des cellules interstitielles (CIV) isolement est simple.
Abstract
Les valves cardiaques sont seul responsable du maintien du flux sanguin unidirectionnel à travers le système cardio-vasculaire. Ces minces, des tissus fibreux sont soumis à des contraintes mécaniques importantes car elles s'ouvrent et se ferment plusieurs milliards de fois sur une durée de vie. L'endurance incroyable de ces tissus est due à la valvulopathie résidents endothéliales (VEC) et les cellules interstitielles (CIV) qui ne cessent de réparation et de remodelage en réponse à des signaux locaux mécaniques et biologiques. Ce n'est que récemment que nous avons commencé à comprendre les comportements uniques de ces cellules, dont l'expérimentation in vitro a joué un rôle clé. Particulièrement difficile est l'isolement et la culture du CVE. Une attention particulière doit être utilisé à partir du moment où le tissu est retiré de l'hôte par plaquage finale. Nous présentons ici des protocoles pour l'isolement direct, l'isolement secondaires spécifiques, la culture, et la vérification des populations pures de CVE. Nous utilisons la digestion enzymatique suivie d'une technique de raclage tige doux pour déloger les cellules de surface seulement. Ces cellules sont ensuite recueillies dans un tube et centrifugée dans une pastille. Le culot est ensuite remis en suspension et plaquées dans des flacons de culture pré-enduites de collagène I matrice. Phénotype VEC est confirmée par le contact a inhibé la croissance et l'expression des marqueurs endothéliaux spécifiques tels que PECAM1 (CD31), facteur von Willebrand (VWF), et l'expression négative de l'actine musculaire lisse alpha (α-SMA). Les caractéristiques fonctionnelles de VEC sont associés à des niveaux élevés de LDL acétylées. Contrairement cellules endothéliales vasculaires, CVE ont la capacité unique de se transformer en mésenchyme, qui se produit normalement lors de la formation embryonnaire, la vanne 1. Cela peut également survenir lors de façon significative après confluentes prolongée de culture in vitro, ainsi le soin doit être fait pour le passage ou à proximité de confluence. Après isolement CVE, des populations pures de CIV peuvent ensuite être facilement acquis.
Protocol
Discussion
Une bonne compréhension de la biologie valvulaires a été altérée par des difficultés techniques d'isolement et de culture des populations pures de cellules endothéliales valvulaires. Techniques d'isolement typiques impliquent la digestion enzymatique de la matrice sous-jacente basale ou chimique de dissociation des liaisons adhésives endothéliales 2,3. Expériences d'isolement préliminaires ont été évalués qualitativement par la variation des agents de dissociation et de périodes d&…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche est soutenue par la bourse de carrière NSF, la Fondation Hartwell, et l'American Heart Association (# 0830384N).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech | 50-103-PB | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| DPBS | Gibco | 21300-058 | ||
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Critical Swabs | VWR | 89031-270 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | ||
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | ||
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | ||
| 24 Well Plate | Falcon | 353047 | ||
| 60×15 mm Dishes | VWR | 25384-092 | ||
| 60×15 Glass Dishes | VWR | 89000-310 | ||
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | ||
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | ||
| 500 mL Nalgene Filters | VWR | 73520-985 | ||
| 1L Nalgene Filters | VWR | 73520-986 | ||
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | ||
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
Riferimenti
- Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue. Am J Anat. 154, 545-556 (1979).
- Johnson, C. M., Fass, D. N. Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro. Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).
- Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin. J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).
- Cheunyg, W. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).
- Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).
- Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves. Circ Res. 96, 792-799 (2005).
- Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).
- Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2. Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Shi, Q. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
- Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation. 107, 1164-1169 (2003).
