En este artículo se proporciona un método para aislar y cultivar la codorniz o pollo HH14<sup> -</sup> Válvula de células del endocardio y HH25 células mesenquimales amortiguador de la válvula.
Abstract
Formación adecuada y la función de las válvulas del corazón embrionario es crítica para la progresión del desarrollo. El corazón embrionario temprano es un tubo en forma de U del endocardio rodeado de miocardio. El miocardio secreta gelatina cardíaca, una matriz rica en ácido hialurónico gelatinosa, en el nódulo auriculoventricular (AV) y el tracto de salida (OFT) del lumen. En la etapa HH14 valvulogenesis comienza cuando un subconjunto de las células endocárdicas, recibir señales de miocardio, endocardio someterse a la transformación de mesenquimales (EMT), e invadir la gelatina cardíaca. En la etapa HH25 los cojines son totalmente valvular mesenchymalized, y esto es lo que finalmente mesénquima forma el aparato valvular y del tabique del corazón. Comprensión de los mecanismos que inician y modulan el proceso de diferenciación celular y la EMT son importantes debido a su conexión con graves defectos congénitos del corazón. En este estudio se presentan los métodos para aislar pre-EMT endocárdica y después de la EMT células mesenquimales, que son los dos diferentes fenotipos de células del cojín prevalvular. Pre-EMT endocardial células pueden ser cultivadas con o sin el miocardio. Después de la EMT células mesenquimales colchón AV pueden ser cultivadas en el interior mecánicamente restringido o sin estrés geles de colágeno. Estas 3D en modelos in vitro imitar los principales eventos morfogénicos valvular y son útiles para la deconstrucción de los mecanismos de valvulogenesis etapa temprana y tardía.
Protocol
1. Preparación Incubar codorniz fértiles o huevos de gallina para la 14 ª etapa – (alrededor de 2 días) o 25 (alrededor de 4,5 días) en 60% de humedad y 37 º C. Prepare la solución de Earl estéril de salina balanceada (EBSS) Añadir 100 ml EBSS 10 veces a 600 ml de agua 18 mW Añadir 2,2 g de bicarbonato sódico Ajustar el pH de la solución a 7,2 Llevar la solución a 1000 ml Esterilizar la solución al pasar por un filtro de 0,2 m…
Discussion
El método para aislar células del endocardio de la etapa HH14 – corazones desarrollado originalmente por Runyan y Markwald proporciona un entorno controlado, en el entorno in vitro para estudiar los factores que inician y modular embrionarias EMT 2. HH14 – explantes cultivados sin endocardio miocardio no someterse a EMT, sin intervención biomecánicas o bioquímicas. Si el miocardio se deja en el explante se dará la señal de un subconjunto de las células endocárd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación es apoyada por la Fundación Hartwell, la Asociación Americana del Corazón (Desarrollo Científico Subvención # 0830384N) y la Fundación Leducq: 07CVD04 mitral.
Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (44), e2159, doi:10.3791/2159 (2010).