Isolierung und Kultivierung von Avian Embryonale Valvular Progenitorzellen

Summary

Dieser Artikel wird eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Wachteln oder Huhn HH14^- Ventil endokardiale Zellen und HH25 Ventil Kissen mesenchymalen Zellen.

Abstract

Korrekte Ausbildung und Funktion der embryonalen Herzklappen ist entscheidend für Entwicklungsfortschritt. Die frühe embryonale Herz ist ein U-förmiges Rohr von Endokard von Myokard umgeben. Der Herzmuskel sondert kardiale Gelee, ein Hyaluronan reichen gallertartige Matrix, in die atrioventrikulären (AV)-Übergang und Ausflusstrakt (OFT) Lumen. Im Stadium HH14 valvulogenesis beginnt, wenn eine Teilmenge von endokardiale Zellen Signale aus dem Myokard zu erhalten, unterziehen endokardiale mesenchymale Transformation (EMT) und dringen in das Herz-Gelee. Im Stadium HH25 die Klappen Kissen sind vollständig mesenchymalized, und es ist dieses Mesenchym, die schließlich bildet die Herzklappen und septalen Apparat des Herzens. Das Verständnis der Mechanismen, und initiieren modulieren den Prozess der EMT und Zelldifferenzierung sind wegen ihrer Verbindung zu schweren angeborenen Herzfehlern wichtig. In dieser Studie präsentieren wir Methoden vor, EMT endokardiale und post-EMT mesenchymalen Zellen, die die beiden verschiedenen Zell-Phänotypen der prevalvular Kissen sind zu isolieren. Pre-EMT endokardiale Zellen können mit oder ohne den Herzmuskel gezüchtet werden. Post-EMT AV Kissen mesenchymalen Zellen können in mechanisch eingeschränkt oder Stress-free Kollagengelen kultiviert werden. Diese 3D-in vitro-Modelle zu imitieren Schlüssel valvular morphogenic Veranstaltungen und sind für die Dekonstruktion der Mechanismen der Früh-und Spätstadium valvulogenesis nützlich.

Protocol

1. Vorbereitung Inkubieren fruchtbaren Wachtel oder Hühnereier zu Stufe 14 – (ca. 2 Tage) oder 25 (ca. 4,5 Tage) bei 60% Luftfeuchtigkeit und 37 ° C. Bereiten Sie sterile Earls Balanced Salt Solution (EBSS) Add 100 ml 10x EBSS zu 600 ml 18 MOhm Wasser Add 2,2 g Natriumbicarbonat Den pH-Wert der Lösung auf 7,2 Bringen Sie die Lösung bis zu 1000 ml Sterilisieren Sie die Lösung, indem sie durch einen 0,2 um Filter Bere…

Discussion

Das Verfahren zur Isolierung von Zellen aus endokardiale Bühne HH14 ^{– hearts} ursprünglich von Runyan und Markwald entwickelt eine kontrollierte, in vitro Umgebung, um die Faktoren, und initiieren modulieren embryonalen ^{EMT-2-Studie.} HH14 ^– endokardiale Explantate ohne Myokard kultiviert wird nicht unterziehen EMT ohne biomechanische oder biochemische Intervention. Wenn der Herzmuskel auf dem Explantat linken Seite ist es Signal eine Teilmenge von endokardiale Zellen mesenchyma…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Extra fine Bonn scissors, curved		Fine Science Tools	14085-08
Dumont tweezers #55		World Precision Instruments, Inc.	14099
Dumont tweezers #5		World Precision Instruments, Inc.	14098
Sterile transfer pipettes		Samco Scientific	2041S
4-well culture plates		Nunc	176740
Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane		Nalgene	566-0020
Sterile 15 mL centrifuge tubes		Corning	430828
Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm		VWR International	25384-342
Laboratory tape		VWR International	89097-920
Rat-tail collagen I		BD Biosciences	354236
10X Earl’s Balanced Salt Solution		Quality Biological, Inc.	119-064-131
M199 powder		Invitrogen	31100-035
Penicillin-Streptomycin		Invitrogen	15140-122
Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)		Invitrogen	41400-045
Chicken serum		Invitrogen	16110-082
0.25% Trypsin-EDTA		Invitrogen	25200-056
Sodium bicarbonate		Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide solution, 1.0 N		Sigma-Aldrich	S2770
Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)		Lake Cumberland Game Bird Farm
Fertile chicken eggs (Gallus gallus)		Cornell University Poultry Farm