Isolamento e la coltura di cellule embrionali aviaria progenitrici valvolare

Summary

Questo articolo fornisce un metodo per isolare e quaglia coltura o pollo HH14^- Valvola di cellule endocardico e HH25 cellule mesenchimali cuscino valvola.

Abstract

Un'adeguata formazione e la funzione delle valvole cardiache embrionali è fondamentale per la progressione di sviluppo. Il cuore embrionale precoce è un tubo a U di endocardio circondato da miocardio. Miocardio secerne pappa cardiaci, un acido ialuronico ricco di matrice gelatinosa, nel nodo atrioventricolare (AV) e del tratto di efflusso (OFT) lumen. Nella fase HH14 valvulogenesis inizia quando un sottogruppo di cellule endocardico ricevere segnali dai miocardio, sottoposti endocardico alla trasformazione mesenchimale (EMT), e invadono la pappa cardiaci. Nella fase HH25 i cuscini sono completamente valvolare mesenchymalized, ed è questo mesenchima che forma poi l'apparato valvolare e del setto del cuore. La comprensione dei meccanismi che innescano e modulano il processo di differenziazione delle cellule EMT e sono importanti per la loro connessione con gravi difetti cardiaci congeniti. In questo studio presenteremo i metodi per isolare pre-EMT endocardico e post-EMT cellule mesenchimali, che sono le due fenotipi cellulari diversi del cuscino prevalvular. Pre-EMT cellule endocardico possono essere coltivate con o senza il miocardio. Post-EMT cuscino AV cellule mesenchimali possono essere coltivate gel di collagene all'interno meccanicamente vincolato o senza stress. Queste 3D di modelli in vitro imitare principali eventi morfogenici valvolare e sono utili per decostruire i meccanismi di valvulogenesis fase precoce e tardiva.

Protocol

1. Preparazione Incubare uova di quaglia fertile o pollo allo stadio 14 – (circa 2 giorni) o 25 (circa 4,5 giorni) a 60% di umidità e 37 ° C. Preparare la soluzione Balanced Salt Earl è sterile (EBSS) Aggiungere 100 mL EBSS 10X a 600 ml di acqua 18 MΩ Aggiungere 2,2 g di sodio bicarbonato Regolare il pH della soluzione a 7,2 Portare la soluzione fino a 1000 ml Sterilizzare la soluzione passa attraverso un filtro 0,2 micron </l…

Discussion

Il metodo per isolare le cellule endocardico da stadio HH14 ^{– Cuori} originariamente sviluppato da Runyan e Markwald fornisce una controllata, di ambiente vitro per studiare i fattori che innescano e modulano embrionale EMT ^2. HH14 ^– espianti endocardico colta senza miocardio non subirà EMT senza l'intervento biomeccanici o biochimici. Se il miocardio è lasciato sul espianto sarà il segnale di un sottogruppo di cellule endocardico a subire la trasformazione mesenc…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Extra fine Bonn scissors, curved		Fine Science Tools	14085-08
Dumont tweezers #55		World Precision Instruments, Inc.	14099
Dumont tweezers #5		World Precision Instruments, Inc.	14098
Sterile transfer pipettes		Samco Scientific	2041S
4-well culture plates		Nunc	176740
Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane		Nalgene	566-0020
Sterile 15 mL centrifuge tubes		Corning	430828
Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm		VWR International	25384-342
Laboratory tape		VWR International	89097-920
Rat-tail collagen I		BD Biosciences	354236
10X Earl’s Balanced Salt Solution		Quality Biological, Inc.	119-064-131
M199 powder		Invitrogen	31100-035
Penicillin-Streptomycin		Invitrogen	15140-122
Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)		Invitrogen	41400-045
Chicken serum		Invitrogen	16110-082
0.25% Trypsin-EDTA		Invitrogen	25200-056
Sodium bicarbonate		Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide solution, 1.0 N		Sigma-Aldrich	S2770
Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)		Lake Cumberland Game Bird Farm
Fertile chicken eggs (Gallus gallus)		Cornell University Poultry Farm